$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
1. Kasılmanın ölçülmesi (örnek SMC'ler)
- Bir 96w10e ECIS dizisi hazırlayın (büyütülmüş elektrotlar ve elektrotlar üzerine yerleştirilmiş hücreler ile dizinin temsili bir görüntüsü için Şekil 1A'ya bakın).
NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Steril bir 96w10e dizisini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 200 μL 10 mM L-sistein ile kaplayın.
- Plakayı iki kez steril suyla yıkayın. Plakayı, kapağı hafifçe açık olacak şekilde doku kültürü başlığında gece boyunca kurumaya bırakın.
NOT: Plakanın L-sistein ile kaplanması yalnızca plakayı ilk kez kullanırken gereklidir.
- Ertesi gün, plakayı ve kapağı 30 dakika boyunca UV ile sterilize edin. İç kısım sterilize olacak şekilde kapağı yukarı doğru çevirin. Plaka sterilize edildikten sonra, plakayı akış başlığının dışında açmayın.
- ECIS dizisinde hücrelerin tohumlanması
- % 1 steril jelatin çözeltisini su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.
NOT: Çözelti buzdolabında saklanır ve katılaşarak pipetlemeyi zorlaştırabilir.
- Daha sonra, kuyucukları oyuk başına 100 μL% 1 jelatin çözeltisi ile kaplayın ve plakayı en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Jelatini kuyulardan aspire edin.
- Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve SMC'leri 200 μL SMC ortamında 30.000 hücre / kuyu tohumlama yoğunluğunda üç kopya halinde tohumlayın.
- SMC'lerin bulunduğu plakayı hücre kültürü inkübatöründeki ECIS 96 kuyulu tutucuya yerleştirin. ECIS Applied Biophysics yazılımına çift tıklayarak programı açınız ve Setup (Kurulum) butonuna basınız.
- Tüm elektrotların Kuyu Konfigürasyonu etiketli sol alt paneldeki tutucu (yeşil; bağlantı yoksa kırmızı) ile temas edip etmediğini kontrol edin. Elektrotlar düzgün bağlanmamışsa, ölçüme başlamadan önce tutucudaki plakayı ayarlayın.
- Dizi türü'ne tıklayarak aynı panelde plaka türünü (96 kuyulu dizi) seçin.
- Sağ üst panelde Veri Toplama Kurulumunda, tek frekansa tıklayın ve empedans değerini 4000 Hz ve aralığı 8 s olarak değiştirin.
- Ölçümleri başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. ECIS dosyasının kaydedilebileceği yeni bir panelin açılmasını bekleyin.
- Hücrelerin 48 h.
için bir tek tabaka oluşturmasına ve oluşturmasına izin verin
NOT: Hücrelerin elektrotlar üzerine bağlanması ve yayılması, bir temel direnç değeri oluşturur (Şekil 1B).
- Kasılmayı indüklemek için hücrelerin uyarılması
- Hücreleri 10 μg/mL kalsiyum iyonofor, iyonomisin.
ile uyararak SMC kasılmasını indükleyin
NOT: İyonomisin, kasılma kaskadını aktive ederek hücre dışı Ca2 + akışını indükleyecektir; uyarılmamış ve uyarılmış sözleşmeli hücrelerin temsili görüntüleri için Şekil 2A'ya bakınız.
- 10 mg / mL'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 1 mg iyonomisin tozunu 100 μL dimetilsülfoksit içinde seyreltin ve 10 μL alikotları -20 ° C'de saklayın. Kullanmadan önce, hücrelere eklenecek çalışma solüsyonunu hazırlamak için iyonomisin solüsyonunu SMC ortamında 1:10 oranında seyreltin.
- Hücre stimülasyonunu, dizi hala hücre kültürü inkübatörünün içindeki dizi tutucusundayken ve elektrotlar sisteme bağlıyken gerçekleştirin.
- Hücreleri uyarmak için kapağı çıkarın ve inkübatörün içindeki steril bir yüzeye yerleştirin. 2 μL ve 150 μL'ye ayarlanmış iki pipet hazırlayın.
- Stimülasyona başlamadan önce yazılımda İşaretle'ye basın ve bir yorum yapın.
NOT: Bu, verileri analiz ederken stimülasyonun tam zamanlamasını bulmayı kolaylaştıracaktır.
- Her birine mümkün olan en kısa sürede 2 μL iyonomisin çalışma solüsyonu pipetleyin. Tüm hücreler uyarıldıktan sonra, ikinci pipeti kullanarak ortamı kuyucuklarda karıştırın.
NOT: Hızlı etkiler nedeniyle, farklı hücre hatları ve koşulları arasında uçları değiştirmek gerekli değildir. İyonomisin akut bir etkiye sahip olduğu için uyarırken ve karıştırırken hızlı çalışın. Dolu bir plakayı uyarırken, aynı anda en fazla 3 sütunu uyarın. Her stimülasyondan sonra, hücrelerin inkübatör kapısının açılmasından kaynaklanan sıcaklık ve CO2 değişiminden kurtulmasını sağlamak için bir sonraki stimülasyona kadar en az 30 dakika bekleyin.
- Stimülasyon yapıldıktan hemen sonra, stimülasyonun yapıldığına dair bir yorum eklemek için tekrar İşaretle'ye basın.
- Stimülasyon deneyinin bitirilmesi
- İyonomisin stimülasyonundan yaklaşık 5 dakika sonra empedans değerlerini kaydedin. Bitir'e basarak kaydı bitirin.
