Kayan Aktin Filament Deneyi: İmmobilize Miyozinler Üzerinde Aktin Filamentlerinin Translokasyonunu İncelemek İçin Bir İn Vitro Motilite Testi

Özet

Kaynak: Tripathi, A., et al. İn vitro Floresan Mikroskopi Tabanlı Motilite Testlerinin Miyozin Spesifik Uyarlamaları. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, aktin-miyozin etkileşimlerini analiz etmek için bir in vitro motilite testi gerçekleştiriyoruz. Aktin filamentlerinin hareketsizleştirilmiş miyozin molekülleri üzerindeki kayma hareketi, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Protokol

1. Kayma aktin filament deneyi

1. Lamel hazırlama
   1. Amil asetat içinde% 1'lik bir nitroselüloz çözeltisi yapın.
   2. Bir doku kültürü kabı (150 x 25 mm) alın ve kabın altına dairesel bir filtre kağıdı (125 mm çapında) ekleyin.
   3. Sekiz adet No. 1.5 kalınlığında 22 mm kare lamelleri bir rafa yükleyin ve yaklaşık 2-5 mL 200 geçirmez etanol ve ardından 2-5 mL damıtılmış su (dH_{, 2}O) ile yıkayın. Su ile bitirerek bu yıkama adımını tekrarlayın. Ardından, filtrelenmiş bir hava hattı veya N₂ hattı kullanarak lamelleri tamamen kurutun.
   4. Bir lamel alın ve kaymanın bir kenarı boyunca 10 μL% 1 nitro....

Sonuçlar

Şekil 1: İşlevselleştirilmiş akış hücresi odalarının hazırlanması. (A) Temizlenmiş bir mikroskop lamı, yaklaşık 2 cm'ye kesilmiş iki parça çift taraflı bant ve işlevsel bir lamel ile başlayın. (B) Bandı mikroskop lamının ortasına ekleyin. (C) Lameli kaplama (yani nitroselüloz) aşağı bakacak şekilde banda takın ve lamelin hazneye yapıştığından emin o.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amil Asetat	Ladd Araştırma Endüstrileri	10825
ATP	Millipore Sigma	A7699
Sığır Serumu Albümin	Millipore Sigma	5470
Calmodulin		PMID: 2985564
Katalaz	Millipore Sigma	C40
Dairesel Filtre Kağıdı - Kayma Testi	Millipore Sigma
Lamel Rafı	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Lameller: Kayma Etkili Filament Testi	VWR International	48366-227
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Çift Taraflı Bant	Ofis Deposu	909955
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Etanol	Fischer Scientific	A4094
G-aktin		PMID: 4254541	G-aktin stoğu 200 & mu'da saklanabilir; Sıvı N2 içinde M.
Glikoz	Millipore Sigma	G8270
Glikoz Oksidaz	Millipore Sigma	G2133
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Büyük Delikli Pipet	Uçları Fischer Scientific	02-707-134
Metilselüloz	Kırlangıç Sigma	M0512
Mikroskop Slaytları	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
Nitroselüloz	Ladd Araştırma Endüstrileri	10800
Tıraş Bıçağı Ofis	Deposu	397492
Rhodamine-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	R415	Stok, %100 ve nbsp; metanol içinde 200 μ M'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltilebilir.
Doku Kültürü Kabı - Kayma Deneyi	Corning	353025	Her doku kültürü kabı yaklaşık dokuz lamel alabilir.
Düz kenarlı 200 & mikro; L Pipet	Uçları Thomas Scientific	1158U38
EKİPMAN
	Santrifüj ThermoFisher Scientific	75006590
Mikroskobu	Nikon	Model: 100x TIRF Objektif ile H-TIRF sistemli Eclipse Ti (NA 1.49)
Mikroskop Kamera	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD kamera (1024 x 1024 sensör formatı)
Mikroskop Çevre Kontrol Kutusu	Tokai HIT	Özel Thermobox
Mikroskop Lazer Ünitesi	Nikon	LU-n405nm, 405nm, 488nm ve 561nm için katı hal lazerli dört lazer ünitesi

WHA1001125 Optima Max-Xp Masaüstü Ultrasantrifüj Beckman Coulter 393315