Ters Motilite Testi: İmmobilize Aktin Filamentleri Üzerinde Miyozin Hareketini Görselleştirmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Özet

Kaynak: Tripathi, A., et al. İn vitro Floresan Mikroskopi Tabanlı Motilite Testlerinin Miyozin Spesifik Uyarlamaları. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, aktin-miyozin etkileşimlerini analiz etmek için bir in vitro motilite testi gerçekleştiriyoruz. Aktin filamentlerinin hareketsizleştirilmiş miyozin molekülleri üzerindeki kayma hareketi, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Protokol

1. Protein saflaştırma

1. Hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu
   1. Tablo 1.5'e göre 1x Ekstraksiyon Tamponu hazırlayın. Süzün ve 4 °C'de saklayın.
   2. Hücre peletlerini buz üzerinde çözdürmeye başlayın. Peletler çözülürken, 1.2 mM ditiotreitol (DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0.5 μM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve iki proteaz inhibitör tablet ile 100 mL Ekstraksiyon Tamponunu destekleyin. Buz üzerinde tutun.
   3. Pelet çözüldükten sonra, 10 mL hücre kültürü başına 1 mL takviye edilmiş Ekstraksiyon Tamponu ekleyin. Örneğin, hücre peletleri 500 mL hücre kültüründen oluşturulmuşsa, pelete 50 mL takviye edilmiş Ekstraksiyon Tamponu ekleyin.
   4. Hücre peletlerini buz üzerinde tutarken sonikasyon. Her pelet için aşağıdaki koşulları kullanın: 5 sn AÇIK, 5 sn KAPALI, 5 dakika süre, güç 4-5.
   5. Tüm homojenize lizatı bir beherde toplayın ve ATP'nin nihai konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde ATP (0.1 M stok çözeltisi; pH 7.0) ekleyin. Soğuk bir odada 15 dakika karıştırın. ATP, aktif miyozini aktinden ayırır ve bir sonraki santrifüjleme adımında ayrılmasına izin verir. Bu nedenle, ATP'nin tükenmesi ve aktine yeniden bağlanma olasılığını en aza indirmek için hemen bir sonraki adıma geçmek önemlidir.
   6. Lizatları 48.000 x g'da 4 ° C'de 1 saat boyunca santrifüjleyin. Bu gerçekleşirken, üreticinin talimatlarına göre 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 100 mL %50 bulamaç Anti-FLAG afinite reçinesi (1 L hücreden oluşan bir pelet için) yıkamaya başlayın. Örneğin, 5 mL reçine için, 10 mL% 50'lik bir bulamacı yıkayın. Son yıkama adımında, reçineyi %50'lik bir bulamaç oluşturmak için yeterli hacme sahip 1-5 mL PBS ile yeniden süspanse edin.
   7. Lizat santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı yıkanmış reçine bulamacı ile birleştirin ve soğuk odada 1-4 saat boyunca hafifçe sallayın. Beklerken Tablo 1'de anlatılan tamponları yapın ve buz üzerinde tutun.
2. FLAG afinite saflaştırma hazırlığı
   1. Çözeltiyi adım 1.7'de 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Reçine tüpün dibinde paketlenecektir. Reçineyi rahatsız etmeden, süpernatanı çıkarın.
   2. Reçineyi Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi 50 mL Tampon A'da yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Reçineyi rahatsız etmeden, süpernatanı çıkarın.
   3. Reçineyi Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi 50 mL Tampon B'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın ve reçineyi 20 mL Tampon B'de yeniden süspanse edin. Ardından, tüpü yaklaşık 10 kez elle hafifçe ters çevirerek reçineyi ve tamponu iyice karıştırın.
3. Protein elüsyonu ve konsantrasyonu
   1. Tablo 1'de anlatıldığı gibi 30 mL Elüsyon Tamponu yapın ve buz üzerinde soğumaya bırakın.
   2. Elüsyon sütununu soğuk bir odada ayarlayın. Reçine bulamacını yavaşça kolona dökün. Reçinenin kurumamasını sağlamak için sütunu 1-2 sütun hacminde Tampon B ile altta reçine paketleri olarak yıkayın.
   3. 1 mL Elüsyon Tamponunu reçineden geçirin ve akışı 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın. 12, 1 mL fraksiyonlar toplanacak şekilde tekrarlayın.
   4. Bu noktada, hangi kesirlerin en konsantre olduğunu niteliksel olarak belirlemek için kesirler üzerinde ham bir Bradford testi yapın. 96 oyuklu bir plakanın bir sırasında, 60 μL 1x Bradford reaktifi pipetleyin. Fraksiyonlar toplanırken, kuyucuk başına her fraksiyondan 20 μL karıştırın. Daha koyu mavi bir renk, daha konsantre fraksiyonları gösterir.
   5. 50 mL'lik bir tüpte, kalan Elüsyon Tamponunu kolon boyunca nazikçe pipetleyerek kalan proteini toplayın, böylece kolon akışında reçineye bağlı kalan miyozini serbest bırakın. Bu akış bir sonraki adımda yoğunlaşacaktır. Reçinenin daha sonra yeniden kullanım için yeniden üretildiğinden ve üreticinin talimatlarına göre saklandığından emin olun.
   6. En konsantre üç fraksiyonu bir araya getirin ve 100.000 MWCO'luk bir konsantre tüp kullanarak 50 mL'lik tüpte ve kalan 1 mL'lik fraksiyonlarda akışı daha da yoğunlaştırın. Havuzlanmış numuneyi konsantre tüpe yükleyin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 750 x g'da santrifüjleyin ve ayrıştırılan tüm protein yaklaşık 0.5-1 mL.
      'lik bir nihai hacme konsantre olana kadar tekrarlayın not: Bu gözenek boyutu, moleküler ağırlık sınırının birkaç katı kütleye sahip olan miyozin moleküllerinin tutulmasına izin verir. Hafif zincirler, nihai ürün üzerinde SDS-PAGE jel elektroforezi gerçekleştirilerek doğrulandığı üzere, bu konsantrasyon süresi boyunca motor alanlarına sıkı bir şekilde bağlı kalır.
4. Diyaliz ve flaş dondurma
   1. Tablo 1'de anlatıldığı gibi 2 L Diyaliz Tamponu yapın. Numuneyi bir diyaliz torbasına veya haznesine yükleyin ve gece boyunca soğuk odada diyalize girin.
      not: M5a-HMM durumunda, gece diyalizinden sonra, protein sonraki tahlillerde kullanım için yeterince saf olacaktır. Gerekirse jel filtrasyonu veya iyonik değişim kromatografisi gibi daha ileri saflaştırma adımları gerçekleştirilebilir.
5. Diyaliz sonrası miyozinin geri kazanılması
   1. M5a-HMM için, tüm numuneyi diyaliz odasından dikkatlice toplayın ve istenmeyen agregaların mevcut olması durumunda 4 ° C'de 15 dakika boyunca 49.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı al.
6. Konsantrasyon tayini ve flaş dondurma
   1. Ürünün konsantrasyonunu belirlemek için absorbansı 260, 280, 290 ve 320 nm dalga boylarında bir spektrofotometre kullanarak ölçün. Denklem 1 ile konsantrasyonu mg / mL (c_{mg / mL}) cinsinden hesaplayın, burada A_{280, 280} nm'deki absorpsiyonu ve A₃₂₀, 320 nm'deki absorpsiyonu temsil eder. Elde edilen mg / mL konsantrasyonu, Denklem 2 ile μM miyozin moleküllerine dönüştürülebilir, burada M, tüm proteinin moleküler ağırlığıdır (ağır zincirler, hafif zincirler, floroforlar ve tüm etiketler dahil).
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM molekülleri = 1000c_mg/mL/M (2)
      not: Bir seyreltme gerekiyorsa, o zaman yüksek iyonik kuvvete sahip bir tamponda yapılmalıdır. Sönme katsayısı (ε), proteinin amino asit dizisinin ExPASy gibi bir programa aktarılmasıyla belirlenebilir. M5a-HMM için tipik verim yaklaşık 0.5-1 mL 1-5 mg / mL proteindir. Bu yazıda kullanılan M5a-HMM için yok olma katsayısı 0.671 idi.
   2. Saflaştırılmış miyozini iki yoldan biriyle saklayın. 10-20 μL arasında, polimerizasyon zincir reaksiyon tüpü gibi ince duvarlı bir tüpe alın ve tüpü hızlı dondurma için bir sıvı nitrojen kabına bırakın. Alternatif olarak, 20-25 μL miyozini doğrudan sıvı nitrojene pipetleyin ve donmuş protein boncuklarını steril kriyojenik tüplerde saklayın. Her iki durumda da, elde edilen tüpler ileride kullanılmak üzere -80 °C veya sıvı nitrojen içinde saklanabilir.
      not: Aşağıda tarif edilen motilite testi çok az miktarda protein gerektirdiğinden, tarif edildiği gibi küçük alikotlarda depolama ekonomiktir.

2. Tek moleküllü TIRF testi

1. Lamel hazırlama
   1. Stok tozunu 10 mg alikot (1.5 mL tüplerde) metoksi-Peg-silan (mPEG) ve 10 mg biotin-Peg-silan (bPEG) alikotuna bölün. -20 °C'de kapalı, nemsiz bir kapta saklayın ve 6 ay içinde kullanın.
   2. Sekiz adet No. 1.5H (yüksek hassasiyetli) kalınlıkta 22 mm kare lameli bir rafa yükleyin ve 2-5 mL 200 geçirmez etanol ve ardından 2-5 mL damıtılmış su ile yıkayın. Su ile bitirerek bu yıkama adımını tekrarlayın. Ardından, lamelleri bir hava hattı veya N₂ kullanarak tamamen kurulayın ve 3 dakika boyunca argon ile plazma temizleyin.
   3. Temiz lamelleri filtre kağıdına (90 mm) bir doku kültürü kabına (100 x 20 mm) yerleştirin ve aşağıdaki adımları uygulayarak 70 °C'lik bir fırında inkübe edin.
      NOT: Plazma temizleme, diğer kimyasal temizleme yöntemleriyle değiştirilebilir.
   4. dH₂O ile% 80 etanol çözeltisi hazırlayın ve HCl kullanarak pH'ı 2.0'a ayarlayın. Bunun 1 mL'sini 10 mg mPEG'ye ve 1 mL'sini 10 mg bPEG alikotuna ekleyin. 30 saniyeden fazla sürmemesi gereken çözünme girdabı.
   5. 100 μL bPEG çözeltisi alın ve 900 μL %80 etanol (pH 2.0) ekleyin. Bu çözelti 1 mg / mL bPEG'dir. Ardından, her iki PEG'den aşağıdaki gibi bir çözelti yapın ve iyice karıştırın.
      1. 200 μL 10 mg / mL mPEG (nihai konsantrasyon: 2 mg / mL).
      2. 1 mg / mL bPEG'nin 10 μL'si (nihai konsantrasyon: 10 μg / mL).
      3. 790 μL% 80 etanol (pH 2.0) çözeltisi.
   6. Lamelleri fırından çıkarın. 100 μL PEG solüsyonunu her bir lamel ortasına dikkatlice dağıtın ve yalnızca üst yüzeyin ıslak olduğundan emin olun. Daha sonra fişleri tekrar fırına koyun ve 20 ila 30 dakika inkübe edin.
   7. Lameller, yüzeyde küçük daireler görünecek şekilde delikli bir görünüm almaya başladığında, bunları fırından çıkarın.
   8. Her lamel %100 etanol ile yıkayın, hava hattı ile kurulayın ve tekrar fırına koyun. Yalnızca 2. adımda odalar oluşturmak için gereken süre boyunca kuluçkaya yatırın.
2. Oda hazırlığı
   1. Hazneyi yapmak için bir mikroskop lamını temizleyin. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda iki parça çift taraflı bant kesin.
   2. Mikroskop lamının uzun kenarının ortasına bir parça yerleştirin. Bandın kenarının slaytın kenarıyla hizalandığından emin olun. İkinci bant parçasını, ikisi paralel ve hizalı olacak şekilde ilk bant parçasının yaklaşık 2 mm altına yerleştirin.
   3. Fırından işlevselleştirilmiş lamellerden birini alın (2.1'de oluşturulmuştur). Lameli bandın üzerine, Şekil 1'de gösterildiği gibi, PEG ile kaplanmış tarafı aşağı bakacak ve bantla doğrudan temas edecek şekilde dikkatlice yapıştırın. Bir pipet ucu kullanarak, lamel slayta düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için kayar bant arayüzüne hafifçe bastırın.
   4. Sürgünün üzerinde asılı olan fazla bandı bir jiletle kesin. Bu bölmeler hemen kullanılabilir veya 50 mL'lik bir tüpe çift olarak yerleştirilebilir ve ileride kullanılmak üzere -80 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir. Hemen saklamak önemlidir, aksi takdirde yüzey bozulur.
3. Miyozin 5a TIRF mikroskobu testinin yapılması
   1. Tablo 2'de açıklanan miyozin 5a ters motilite testi için çözeltileri hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
   2. Hazneyi 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın.
   3. 1 mM DTT ile 50 mM MB'de 1 mg / mL BSA'nın 10 μL'sinde akış. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra 1 dakika bekleyin. Çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendil veya filtre kağıdının köşesini kullanın.
   4. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   5. 1 mM DTT ile 50 mM MB'de 10 μL NeutrAvidin solüsyonu akıtın ve 1 dakika bekleyin.
   6. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   7. 50 mM MB'de 1 mM DTT içeren 10 μL biyotinile rodamin aktin (bRh-Actin) içinde akış yapın ve 1 dakika bekleyin. Bu adım için, uzun aktin filamentlerinin yüzeye (20-30 μm veya daha uzun) yapışabilmesini sağlamak için floresan aktin filamentlerinin kesilmesini en aza indirmek için büyük delikli bir pipet ucu kullanın ve yukarı ve aşağı pipetlemekten kaçının. Etkili bir alternatif, standart bir pipet ucunun konisini kesmektir (≈1-1,5 mm'lik bir açıklıkla).
   8. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   9. 10 nM miyozin 5a eklenmiş 30 μL Son Tamponda akıtın, ardından hemen TIRF mikroskobuna yükleyin ve TIRF görüntüleme modalitesi için optimum odağı bulduktan sonra kaydedin. 100-200 ms arasındaki maruz kalma süreleri, aktin ve GFP etiketli miyozin için 1,4 mW lazer gücünde uygundur. Hız analizi için uygun bir edinme süresi 3 dakikadır.

Tablo 1: Protein saflaştırmasında kullanılan tamponlar.

Tampon Adı	kompozisyon	Kullanılan Adım(lar)	Yorum
M5a Ekstraksiyon Tamponu	0,3 milyon NaCl	1.1	Buz üzerinde tutun.
	15 mM MOPS, pH 7.2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Tampon A	0,5 milyon NaCl	2.2	Buzda tutun.
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM DTT
	5 mM MgCl2
Tampon B	0,5 milyon NaCl	2.3	Buz üzerinde tutun.
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM DTT
>Elüsyon Tamponu	0,5 milyon NaCl	3.1	Buz üzerinde tutun.
	0.5 mg / mL BAYRAK peptit
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7.2
M5a Diyaliz Tamponu	500 mM KCl	4.1	Hacme getirmek için soğuk dH2O kullanın.
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT

Tablo 2: TIRF tahlilinde kullanılan tamponlar.

Tampon Adı	kompozisyon	Kullanılan Adım(lar)	Yorum
>4X Hareketlilik Tamponu (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7.2		Vakumla filtreleyin ve 4°C'de saklayın
	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA
	pH 7.4
50 mM tuz Motilite Tamponu (50 mM MB)	%25 v/v 4X MB		Süzgeç ve 4°C'de saklayın
	50 mM KCl
	dH2O ile ses seviyesini yükseltin
150 mM tuz Motilite Tamponu (150 mM MB)			Filtreyi vakumlayın ve 4°C'de saklayın
Miyozin		"Son Tampon" tarifine bakın	Buz üzerinde tutun.
2 mg/mL NeutrAvidin	2 mg / mL Nötravidin	3.5	Buz üzerinde tutun.
	1 mM DTT
	50 mM MB'de seyreltin
>1 mg / mL sığır serum albümini (BSA)	1 mg/mL BSA	3.3	Buz üzerinde tutun.
	1 mM DTT
	50 mM MB'de seyreltin
200 nM rodamin-phalloidin biyotinile F-aktin (bRh-Aktin)	200 nM rodamin-phalloidin biyotinile F-aktin	3.7	Yukarı ve aşağı girdap yapmayarak veya pipetlemeyerek kesmeyi önleyin. Karıştırmak için yavaşça ters çevirin.
	1 mM DTT
	50 mM MB'de seyreltin
MB DTT ile	50 mM DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Buzda kal.
	50 mM MB'de seyreltin
Son Arabellek	50 mM KCl	3.9	Deneyi gerçekleştirmeden hemen önce glikoz, glikoz oksidaz ve katalazı ekleyin. Buz üzerinde tutun.
	20 mM MOPS, pH 7.2
	5 mM MgCl2
	0,1 mM EGTA
	1 mM ATP
	50 mM DTT
	1 μM kalmodulin
	2.5 mg/mL glikoz
	100 μg/mL glikoz oksidaz
	40 μg/mL katalaz
	10 nM miyozin

Sonuçlar

Şekil 1: İşlevselleştirilmiş akış hücresi odalarının hazırlanması.(A) Temizlenmiş bir mikroskop lamı, yaklaşık 2 cm'ye kesilmiş iki parça çift taraflı bant ve işlevsel bir lamel ile başlayın. (B) Bandı mikroskop lamının ortasına ekleyin. (C) Lameli kaplama aşağı bakacak şekilde banda takın ve lamelin hazneye yapıştığından emin olmak için plastik bir p...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 M MgCl2 Çözeltisi	VWR (VWR)	10128-298
5 M NaCl Çözeltisi	KD Medikal	RGE-3270
asetik asit	ThermoFisher Bilimsel	984303
Anti-FLAG M2 Afinite Jeli	Kırlangıç Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
Atp	Kırlangıç Sigma	A7699
Biyotinile G-Aktin	Hücre İskeleti, Inc.	AB07
Sığır Serumu Albümini	Kırlangıç Sigma	5470
bPEG-silan	Laysan Biyo, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reaktif Konsantresi	Biyo-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Katalaz	Kırlangıç Sigma	C40
SF-900 II SFM'de Hücre Hattı (Sf9)	ThermoFisher Bilimsel	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Dairesel Filtre Kağıdı - Ters Test	Kırlangıç Sigma	WHA1001090
Eksiksiz, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Tabletleri	Kırlangıç Sigma	5056489001	Bu 4 °C'de saklanmalıdır. Tabletler doğrudan kullanılabilir veya 1 tabletin 2 mL damıtılmış suda çözülmesiyle 25x stok çözeltisi olarak yeniden oluşturulabilir. Elde edilen çözelti 4 °C'de 1-2 hafta veya -20 °C'de en az 12 hafta saklanabilir.
Konsantre Tüpler (100.000 MWCO)	EMD Millipore Şirketi	UFC910024	Tüpün MWCO'su, MWCO saflaştırılan proteinin toplam moleküler ağırlığından daha az olduğu sürece, "herkese uyan tek bir boyut" olmak zorunda değildir. M5a, 30.000 MWCO'luk bir tüp ile konsantre edildi.
Coomassie Parlak Mavi R-250 Boya	ThermoFisher Bilimsel	20278
Lamel Rafı	Kırlangıç Sigma	Z688568-1 adet
Lameller: Ters Motilite Testi	Azer Bilimsel	ES0107052
Diyaliz Tüpü (3500 Dalton MCWO)	Fischer Bilimsel	08-670-5A	Diyaliz tüpünün çapı değişebilir, ancak MWCO aynı olmalıdır. Tüpler 4 ° C'de% 20 alkol çözeltisi içinde saklanabilir.
DL-Ditiyotreitol	Kırlangıç Sigma	D0632
Çift Taraflı Bant	Ofis Deposu	909955
DYKDDDDK Peptit	GenScript (GenScript)	RP10586	Bu, 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3 ve 10 mM MOPS (pH 7.2) içeren bir tampon içinde 50 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözülebilir. Bu, -20 ° C'de 300 μL alikotlar halinde saklanabilir.
EGTA (EGTA)	Kırlangıç Sigma	E4378
Elüsyon Sütunu	Biyo-Rad	761-1550	Bunlar tekrar kullanılabilir. Temizlemek için sütunu 2-3 sütun hacmi PBS ve damıtılmış su ile durulayın. Kullanmadan önce sütunu 4°C'de soğutun.
etanol	Fischer Bilimsel	A4094
glikoz	Kırlangıç Sigma	G8270
Glikoz Oksidaz	Kırlangıç Sigma	G2133
Glisin Tampon Çözeltisi, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-295018
Hcl	Kırlangıç Sigma	320331
Kartal	Fischer Bilimsel	P217-500
Büyük Delikli Pipet Uçları	Fischer Bilimsel	02-707-134
Leupeptin Proteaz İnhibitörü	ThermoFisher Bilimsel	78435
Mark12 Boyasız Standart Merdiven	ThermoFisher Bilimsel	LC5677
metanol	Kırlangıç Sigma	MX0482
Mikroskop Slaytları	Fischer Bilimsel	12-553-10
Moplar	Fischer Bilimsel	BP308-100
mPEG-silan	Laysan Biyo, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Kırlangıç Sigma	S8032 Serisi
NeutrAvidin	ThermoFisher Bilimsel	31050
NuPAGE %4 ila %12 Bis-Tris Mini Protein Jeli, 15 kuyulu	ThermoFisher Bilimsel	NP0323PK2
NuPAGE LDS Örnek Tamponu (4X)	ThermoFisher Bilimsel	NP0007
Fosfat Tamponlu Tuzlu Balık, pH 7.4	ThermoFisher Bilimsel	10010023
PMSF (Başbakanlık)	Kırlangıç Sigma	78830	PMSF, izopropanol içinde 0,1 M'lik bir stok çözeltisi olarak yapılabilir ve 4 °C'de saklanabilir. İzopropanol ilavesi, oda sıcaklığında karıştırılarak çözülebilen kristal çökelmesine neden olur. Kullanımdan hemen önce, PMSF, 0.1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar hızla karıştırılan bir çözeltiye damla damla eklenebilir.
Tıraş Bıçakları	Ofis Deposu	397492
Rodamin-Phalloidin	ThermoFisher Bilimsel	R415	Stok, %100 metanol içinde 200 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltilebilir.
Sf9 Medya	ThermoFisher Bilimsel	12658-027	Bu 4 ° C'de saklanmalıdır. Raf ömrü üretim tarihinden itibaren 18 aydır.
Doku Kültürü Kabı - Ters Test	Corning	353003	Her doku kültürü kabı yaklaşık dört lamel tutabilir.
Düz Kenarlı 200 μL Pipet Uçları	Thomas Bilimsel	1158U38
ekipman
merkezkaç	ThermoFisher Bilimsel	75006590
mikroskop	Nikon	Model: 100x TIRF Objektifli H-TIRF sistemli Eclipse Ti (N.A. 1.49)
Mikroskop Kamerası	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD kamera (1024 x 1024 sensör formatı)
Mikroskop Çevre Kontrol Kutusu	Tokai HIT	Özel Termokutu
Mikroskop Lazer Ünitesi	Nikon	405nm, 488nm, 561nm ve 640nm için katı hal lazerli LU-n4 dört lazer ünitesi
Orta Tezgah Santrifüjü	ThermoFisher Bilimsel	Modeli: CR3i
Misonix Sonikatör	Misonix (Misrik)	XL2020
Optima Max-Xp Masaüstü Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	393315
Plazma Temizleyici	Diener electronic GmbH + Co. KG	Sistem Türü: Zepto
Sonikatör Probu (3.2 mm)	Qsonica (İngilizce)	4418
Standart Kuluçka Makinesi	ciltçi	Modeli: 56
Waverly Tüp Mikser	Waverly	TR6E Tezli Yüksek Lisans

Serisi Serisi Serisi Serisi sayılı Kanun Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Yılı Cihazı