Ters Motilite Testi: İmmobilize Aktin Filamentleri Üzerinde Miyozin Hareketini Görselleştirmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Özet

Kaynak: Tripathi, A., et al. İn vitro Floresan Mikroskopi Tabanlı Motilite Testlerinin Miyozin Spesifik Uyarlamaları. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, aktin-miyozin etkileşimlerini analiz etmek için bir in vitro motilite testi gerçekleştiriyoruz. Aktin filamentlerinin hareketsizleştirilmiş miyozin molekülleri üzerindeki kayma hareketi, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Protokol

1. Protein saflaştırma

1. Hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu
   1. Tablo 1.5'e göre 1x Ekstraksiyon Tamponu hazırlayın. Süzün ve 4 °C'de saklayın.
   2. Hücre peletlerini buz üzerinde çözdürmeye başlayın. Peletler çözülürken, 1.2 mM ditiotreitol (DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0.5 μM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve iki proteaz inhibitör tablet ile 100 mL Ekstraksiyon Tamponunu destekleyin. Buz üzerinde tutun.
   3. Pelet çözüldükten sonra, 10 mL hücre kültürü başına 1 mL takviye edilmiş Ekstraksiyon Tamponu ekleyin. Örneğin, hücre peletleri 500 mL hücre kültüründen oluşturulmuşsa, pelete 50 mL takviye edilmiş....

Sonuçlar

Şekil 1: İşlevselleştirilmiş akış hücresi odalarının hazırlanması.(A) Temizlenmiş bir mikroskop lamı, yaklaşık 2 cm'ye kesilmiş iki parça çift taraflı bant ve işlevsel bir lamel ile başlayın. (B) Bandı mikroskop lamının ortasına ekleyin. (C) Lameli kaplama aşağı bakacak şekilde banda takın ve lamelin hazneye yapıştığından emin olmak için plastik bir p.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 M MgCl2 Çözeltisi	VWR (VWR)	10128-298
5 M NaCl Çözeltisi	KD Medikal	RGE-3270
asetik asit	ThermoFisher Bilimsel	984303
Anti-FLAG M2 Afinite Jeli	Kırlangıç Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
Atp	Kırlangıç Sigma	A7699
Biyotinile G-Aktin	Hücre İskeleti, Inc.	AB07
Sığır Serumu Albümini	Kırlangıç Sigma	5470
bPEG-silan	Laysan Biyo, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reaktif Konsantresi	Biyo-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Katalaz	Kırlangıç Sigma	C40
SF-900 II SFM'de Hücre Hattı (Sf9)	ThermoFisher Bilimsel	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Dairesel Filtre Kağıdı - Ters Test	Kırlangıç Sigma	WHA1001090
Eksiksiz, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Tabletleri	Kırlangıç Sigma	5056489001	Bu 4 °C'de saklanmalıdır. Tabletler doğrudan kullanılabilir veya 1 tabletin 2 mL damıtılmış suda çözülmesiyle 25x stok çözeltisi olarak yeniden oluşturulabilir. Elde edilen çözelti 4 °C'de 1-2 hafta veya -20 °C'de en az 12 hafta saklanabilir.
Konsantre Tüpler (100.000 MWCO)	EMD Millipore Şirketi	UFC910024	Tüpün MWCO'su, MWCO saflaştırılan proteinin toplam moleküler ağırlığından daha az olduğu sürece, "herkese uyan tek bir boyut" olmak zorunda değildir. M5a, 30.000 MWCO'luk bir tüp ile konsantre edildi.
Coomassie Parlak Mavi R-250 Boya	ThermoFisher Bilimsel	20278
Lamel Rafı	Kırlangıç Sigma	Z688568-1 adet
Lameller: Ters Motilite Testi	Azer Bilimsel	ES0107052
Diyaliz Tüpü (3500 Dalton MCWO)	Fischer Bilimsel	08-670-5A	Diyaliz tüpünün çapı değişebilir, ancak MWCO aynı olmalıdır. Tüpler 4 ° C'de% 20 alkol çözeltisi içinde saklanabilir.
DL-Ditiyotreitol	Kırlangıç Sigma	D0632
Çift Taraflı Bant	Ofis Deposu	909955
DYKDDDDK Peptit	GenScript (GenScript)	RP10586	Bu, 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3 ve 10 mM MOPS (pH 7.2) içeren bir tampon içinde 50 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözülebilir. Bu, -20 ° C'de 300 μL alikotlar halinde saklanabilir.
EGTA (EGTA)	Kırlangıç Sigma	E4378
Elüsyon Sütunu	Biyo-Rad	761-1550	Bunlar tekrar kullanılabilir. Temizlemek için sütunu 2-3 sütun hacmi PBS ve damıtılmış su ile durulayın. Kullanmadan önce sütunu 4°C'de soğutun.
etanol	Fischer Bilimsel	A4094
glikoz	Kırlangıç Sigma	G8270
Glikoz Oksidaz	Kırlangıç Sigma	G2133
Glisin Tampon Çözeltisi, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-295018
Hcl	Kırlangıç Sigma	320331
Kartal	Fischer Bilimsel	P217-500
Büyük Delikli Pipet Uçları	Fischer Bilimsel	02-707-134
Leupeptin Proteaz İnhibitörü	ThermoFisher Bilimsel	78435
Mark12 Boyasız Standart Merdiven	ThermoFisher Bilimsel	LC5677
metanol	Kırlangıç Sigma	MX0482
Mikroskop Slaytları	Fischer Bilimsel	12-553-10
Moplar	Fischer Bilimsel	BP308-100
mPEG-silan	Laysan Biyo, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Kırlangıç Sigma	S8032 Serisi
NeutrAvidin	ThermoFisher Bilimsel	31050
NuPAGE %4 ila %12 Bis-Tris Mini Protein Jeli, 15 kuyulu	ThermoFisher Bilimsel	NP0323PK2
NuPAGE LDS Örnek Tamponu (4X)	ThermoFisher Bilimsel	NP0007
Fosfat Tamponlu Tuzlu Balık, pH 7.4	ThermoFisher Bilimsel	10010023
PMSF (Başbakanlık)	Kırlangıç Sigma	78830	PMSF, izopropanol içinde 0,1 M'lik bir stok çözeltisi olarak yapılabilir ve 4 °C'de saklanabilir. İzopropanol ilavesi, oda sıcaklığında karıştırılarak çözülebilen kristal çökelmesine neden olur. Kullanımdan hemen önce, PMSF, 0.1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar hızla karıştırılan bir çözeltiye damla damla eklenebilir.
Tıraş Bıçakları	Ofis Deposu	397492
Rodamin-Phalloidin	ThermoFisher Bilimsel	R415	Stok, %100 metanol içinde 200 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltilebilir.
Sf9 Medya	ThermoFisher Bilimsel	12658-027	Bu 4 ° C'de saklanmalıdır. Raf ömrü üretim tarihinden itibaren 18 aydır.
Doku Kültürü Kabı - Ters Test	Corning	353003	Her doku kültürü kabı yaklaşık dört lamel tutabilir.
Düz Kenarlı 200 μL Pipet Uçları	Thomas Bilimsel	1158U38
ekipman
merkezkaç	ThermoFisher Bilimsel	75006590
mikroskop	Nikon	Model: 100x TIRF Objektifli H-TIRF sistemli Eclipse Ti (N.A. 1.49)
Mikroskop Kamerası	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD kamera (1024 x 1024 sensör formatı)
Mikroskop Çevre Kontrol Kutusu	Tokai HIT	Özel Termokutu
Mikroskop Lazer Ünitesi	Nikon	405nm, 488nm, 561nm ve 640nm için katı hal lazerli LU-n4 dört lazer ünitesi
Orta Tezgah Santrifüjü	ThermoFisher Bilimsel	Modeli: CR3i
Misonix Sonikatör	Misonix (Misrik)	XL2020
Optima Max-Xp Masaüstü Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	393315
Plazma Temizleyici	Diener electronic GmbH + Co. KG	Sistem Türü: Zepto
Sonikatör Probu (3.2 mm)	Qsonica (İngilizce)	4418
Standart Kuluçka Makinesi	ciltçi	Modeli: 56
Waverly Tüp Mikser	Waverly	TR6E Tezli Yüksek Lisans

Serisi Serisi Serisi Serisi sayılı Kanun Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Yılı Cihazı