$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
1. huRBL hücrelerinin pasif duyarlılığı
- Önceden inkübe edilmiş Ag8 / serum süspansiyonunu 250 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjlenmiş Ag8 / serum süspansiyonunun 50 μL'sini, Ag8 hücre peletini bozmadan her bir kuyucuk içeren huRBL hücrelerine aktarın.
- Hassaslaştırılmış, ancak uyarılmamış hücreler (antijen eklemeyin) olan antijen kontrolü yok, alt sinyal platosu / arka planı için bir gösterge görevi görüyor. Arka plan ve maksimum lizis kontrol kuyularının serum ile hassaslaştırılmasına gerek yoktur. Bunun yerine kuyuları kontrol etmek için 50 μL huRBL ortamı ekleyin.
- Plakayı kapakla kapatın ve gece boyunca 37 °C ve% 5 -% 7 CO2'de inkübe edin.
2. Antijen ile uyarılan degranülasyon ve aracı salınımı
- Antijen seyreltmesini 1x Tyrode tamponunda (9.5 g / L Tyrode tuzları,% 0.1 sığır serum albümini (BSA),0.5 g / L Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) dH2O cinsinden) önceden hazırlayın. Kuyu başına 100 μL'lik nihai bir miktar gereklidir.
not: Doğal kaynaklardan saflaştırılmış veya rekombinant olarak üretilen her alerjen, 1x Tyrode'un tamponunda stabil olmayabilir. Bu nedenle, test prosedüründen önce 1x Tyrode'un tamponunda stabilite testleri yapın. Alternatif olarak, tahlilin sinyal-gürültü oranını artırmak için 1x Tyrode tamponunu döteryum oksit (D2O) içinde seyreltin.
- 10 veya 1 μg/mL protein ile başlayan reaksiyon tüplerinde 1:10 seyreltme serisinin ilgilenilen antijeninden 8 seyreltme yapın.
NOT: Seyreltme serisini her zaman önceden test edin. Alternatif olarak, 1:10 seyreltme serisini (örn. 1:5, 1:20 veya 1:30) tam salım eğrisini kapsayacak şekilde uyarlayın. Ek olarak, başlangıç konsantrasyonu deney düzeneğine bağlı olarak değişebilir.
- 96 oyuklu plaka üzerine kaplanmış huRBL hücrelerini yıkamak için, önce plakayı dikkatlice aspire ederek, ters çevirerek ve emici kağıda vurarak serum içeren hücre ortamını çıkarın.
- Hücreleri kuyucuk başına 200 μL 1x Tyrodes tamponu ile yıkayın. Tüm kuyucuklara benzer şekilde davranın.
not: Yıkama solüsyonunu hücrelere rahatsız etmemek için yavaşça ekleyin.
- Yaklaşık 30 saniye bekletin ve yıkama adımını toplamda üç kez tekrarlayın.
- Yıkama solüsyonunu son kez ekledikten sonra, antijen seyreltmesini eklemeye devam etmek için hazır olana kadar solüsyonu kuyucuklarda bırakın.
not: Hücreleri çok uzun süre havaya maruz bırakmaktan kaçının.
- Önceden hassaslaştırılmış huRBL hücrelerini içeren her kuyucuğa 100 μL antijen çözeltisi aktarın.
NOT: Birkaç farklı parametreyi analiz ediyorsanız, seyreltme serisinin tek tek numunelerini bağlayıcı olmayan 96 oyuklu ek bir plakaya aktarın (huRBL plakasındakiyle aynı düzeni kullanın) ve daha sonra bunları çok kanallı bir pipetle doğrudan huRBL hücre plakasına aktarın. Bu şekilde, hücrelerin çok uzun süre havaya maruz kalması önlenebilir, bu da test performansının düşük olmasına (daha düşük / sinyal yok) neden olabilir.
- Kontrol kuyularını (maksimum lizis ve hassaslaştırılmamış arka plan hücreleri) 100 μL 1x Tyrode tamponu ile örtün. Bu kontrol kuyularını antijen ile uyarmayın.
- Ek olarak, veri analizi sırasında duyarlı hücrelerin antijenden bağımsız spontan salınımını hesaba katmak için gerekli olan seyreltme serisinin hassaslaştırılmış antijen olmayan kuyularına 100 μL 1x Tyrode tamponu ekleyin.
- huRBL hücrelerini 37 ° C'de ve% 5 -% 7 CO2'de 1 saat inkübe edin.
3. β-heksosaminidaz aktivitesinin floresan ölçümü
- Maksimum lizis kontrolünün kuyucuklarını oyuk başına 10 μL% 10 Triton X-100 ile muamele edin ve hücreleri tamamen parçalamak ve% 100 β-heksosaminidaz salınımını elde etmek için uygun şekilde karıştırın.
- Yeni, bağlayıcı olmayan 96 oyuklu bir plakaya 50 μL substrat çözeltisi ekleyin. 96 oyuklu bir plaka için substrat çözeltisi: 5 mL 0.1 M sitrik tahlil tamponu, pH 4.5; ve 80 μL 10 mM 4-metilumbelliferil N-asetil-β-D-glukozaminid.
- Tüm oyukların 50 μL hücre süpernatantını substrat çözeltisini içeren yeni plakaya aktarın.
NOT: huRBL hücrelerini bozmamak için süpernatanı huRBL plakasından dikkatlice pipetleyin.
- Florojenik substratın dönüştürülmesine izin vermek için plakayı substrat çözeltisi ve hücre süpernatantı ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
not: Hücre canlılığı testi için huRBL plakasını saklayın.
- Kuyucuk başına 100 μL durdurma çözeltisi (15 g / L glisin, dH2O, pH 10.7 içinde çözülmüş 11.7 g / L NaCl) ekleyin.
- Bir plaka okuyucu kullanarak 360 nm uyarma ve 465 nm emisyonda floresanı ölçün.