$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Büyüme Engelleme Yüksek Verimli Tarama (HTS)
>NOT: Antikanser ajanların hasta kaynaklı tümör organoidlerine (PDO'lar) karşı büyüme inhibitör aktivitesi, Şekil 1'de gösterildiği gibi hücre içi ATP içeriğinin ölçülmesiyle değerlendirilir. Bu adım, ticari olarak temin edilebilen bir hücre canlılığı test kiti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).
- 0. günde, PDO'ları (örn., RLUN007) test için yeterli sayıda hücre kümesi mevcut olana kadar şişelerde. Tohumlamadan bir gün önce, PDO süspansiyonunu 75cm2'lik bir şişeden 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve PDO pelet hacmini ölçmek için 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Ardından, PDO peletini 15 mL taze ortamda yeniden süspanse edin ve 75cm2'lik bir şişeye geri aktarın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2.
içinde kültürleyin
not: Gerekli PDO pelet hacmi, her bir PDO'nun seyreltme hızına ve test için kullanılan 384 oyuklu plakaların sayısına bağlıdır. RLUN007 için, on adet 384 oyuklu plakaya tohumlama için 200 μL'lik bir hücre pelet hacmi gereklidir.
- 1. günde (ortamı değiştirdikten 24 saat sonra), 70 μm gözenekli filtre içeren bir filtre tutucu ile hücre parçalanması ve dağılma ekipmanı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak PDO'ları kıyın. Ardından, 15 mL PDO süspansiyonunu 10 kat seyreltin. 40 μL PDO süspansiyonunu bir hücre süspansiyon dağıtıcısı kullanarak 384 oyuklu ultra düşük bağlantılı küresel (yuvarlak tabanlı) mikroplakalara (Malzeme Tablosuna bakınız) tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
not: Hücre kümelerini kıymak için, piyasada bulunan hücre parçalanması ve dağılması ekipmanının kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Tohumlamadan 24 saat sonra (2. gün), PDO'ları sıvı bir işleyici kullanarak 20 μM ila 1.0 nM (10 seri seyreltme) nihai konsantrasyon aralıklarında 0.04 μL test maddesi solüsyonu ile muamele edin (bkz.
- 8. günde (test maddesi tedavisinden 144 saat sonra), test kuyucuklarına hücre içi ATP ölçüm reaktifi ekleyin. Plakaları bir karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 25 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak hücre içi ATP içeriğini lüminesans olarak ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
- Hücre canlılığını hesaplamak için, test kuyularındaki ATP miktarını, arka plan çıkarılmış olarak aracı içeren kontrol kuyularındaki miktara bölün. 6 günlük büyüme oranını hesaplamak için, tohumlamadan 24 saat sonra araç kontrol kuyularındaki ATP miktarını araç kontrol kuyularındaki miktara bölün.
- Biyolojik veri analiz yazılımı kullanarak doz-yanıt eğrilerinden %50 inhibitör konsantrasyonu (IC50) ve eğri altındaki alan (AUC) değerlerini hesaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Z faktörü, 1 (sonsuz ayırma) ile <0 arasında değişen boyutsuz bir parametredir, Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-| olarak tanımlanır, burada σc+, σc-, μc+ ve μc- yüksek (c+) ve düşük (c σ) kontrollerin standart sapmaları () ve ortalamalarıdır (μ), sırasıyla.
