1. Tüm hücre lizatlarının hazırlanması
- E. coli K-12 ASKA ORFeome toplama suşlarını, 96 oyuklu derin kuyu plakalarında 25 μg/mL kloramfenikol içeren 1,5 mL Lizojeni suyuna (LB) aşılayın. 160 rpm'de çalkalayarak 30 ° C'de 18 saat boyunca gece boyunca (O / N) büyütün. Ertesi gün, 6 saat boyunca 30 ° C'de protein ekspresyonunu indüklemek için O / N kültürlerine izopropil β-d-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG) (son 0.5 mM) ekleyin.
- 10 dakika boyunca 500 x g'da pelet hücreleri. Peletleri kullanana kadar -80 °C'de dondurun. Hücreleri parçalamak için 150 μL lizis tamponu L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 2 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), 40 μg/mL DNaz 1 ve 0.5 mg/mL lizozim) ekleyin peleti yeniden süspanse etmek için.
- Hücreleri -80 ° C'de 30 dakika dondurun ve ardından 37 ° C'de 20 dakika çözdürün. Hücreleri parçalamak için bu döngüyü üç kez tekrarlayın. Lizatları kullanmadan önce -80 °C'de saklayın.
2. Relseq ve GppA'nın saflaştırılması
>NOT: Streptococcus equisimilis'ten Relseq ve E. coli K-12'den GppA rekombinant proteinleri, radyoaktif işaretli pppGpp ve ppGpp'yi sentezlemek için kullanılır.
- Her proteini aşırı eksprese eden hücreleri büyütün ve toplayın.
- E. coli BL21 DE3 suşunu LB suyunda üstel faza (optik yoğunluk (OD) ~ 0.3-0.4) kadar büyütün ve 5 dakika boyunca 6000 x g'da 1 mL kültürü döndürün. Süpernatanı boşaltın ve hücreleri 100 μL buz gibi soğuk TSB suyu (0.1 g / mL PEG3350, 0.05 mL / mL dimetilsülfoksit ile desteklenmiş LB suyu, 20 mM MgCl2).
- Her biri 100 ng olan histidin etiketli relseq ve gppA içeren plazmitleri TSB'deki yukarıdaki hücre süspansiyonları ile karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri 42 ° C'de 40 saniye boyunca ısı şoku ile şok edin. Karışımı 2 dakika buzun üzerine koyun ve hücrelerin 160 rpm'de çalkalama ile 37 ° C'de 1 saat iyileşmesini sağlamak için oda sıcaklığında 1 mL LB suyu ekleyin.
- Geri kazanılan hücreleri, karşılık gelen antibiyotiklerle takviye edilmiş LB agar plakaları üzerine yerleştirin (Relseq: 100 μg / mL ampisilin; GppA: 30 μg/mL kanamisin). Ertesi gün, her iki suşun 37 ° C'de O/N ön kültürlerini başlatmak için kolonileri LB suyunda aşılayın.
- 18 saat sonra, 500 mL LB ortamını 10 mL O / N kültürleri ve karşılık gelen antibiyotiklerle aşılayın. 37 ° C'de 160 rpm'de çalkalayarak kültürleri büyütün. OD600nm 0.5-0.7'ye ulaştığında, 0.5 mM IPTG ekleyerek ve 160 rpm'de çalkalayarak 30 ° C'de 3 saat büyüterek protein ekspresyonunu indükleyin.
- Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6084 x g'da döndürerek toplayın. Peleti 20 mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin ve 1912 x g'da 20 ° C'de 4 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve kullanmadan önce peletleri -20 °C'de dondurun.
- Nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) afinite saflaştırması
not: Bu noktadan itibaren numunelerin soğuk olduğundan emin olun.
- 40 mL buz gibi soğuk lizis tamponu L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM imidazol, proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 10 mM β-merkaptoetanol ekleyin (EDTA içermeyen tablet; bkz. Hücreleri sonikasyon yoluyla parçalayın (% 60 genlik, 2 s AÇIK / 4 s KAPALI 8 dakika AÇIK). 4 ° C'de 40 dakika boyunca 23.426 x g'da döndürerek lizatı temizleyin ve saflaştırma için süpernatan ile devam edin.
- Yukarıdaki santrifüjleme sırasında Ni-NTA reçinesini hazırlayın.
- 500 μL homojenize Ni-NTA reçinesini ayakta duran bir polipropilen kromatografi kolonuna aktarın ve 15 dakika dinlenmesine izin verin ve depolama çözeltisi aksın. Reçineyi 15 mL ultra saf su ile iki kez yıkayın ve ardından sütunu 15 mL lizis tamponu L2 ile yıkayın.
- 1. adımdan itibaren temizlenmiş hücre lizatının süpernatantını kolona yükleyin ve akmasına izin verin. Kolonu 30 mL yıkama tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, %5 gliserol, 20 mM imidazol) ile yıkayın.
- Proteinleri 400 μL elüsyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl,% 5 gliserol, 500 mM imidazol) ile üç kez elute edin. Ardından, 300 μL başka bir elüsyon tamponu ile elüsyonu tekrarlayın. Ayrıştırılmış proteinleri 700 μL'lik bir nihai hacme kadar birleştirin.
- Jel filtrasyonu
- Jel filtrasyon tamponu hazırlayın (50 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl;% 5 gliserol). Boyut dışlama kolonunu, jel filtrasyon tamponunun bir kolon hacmi (25 mL) ile yıkayın.
- Yukarıdaki 700 μL'lik numuneyi 500 μL'lik bir döngü kullanarak yükleyin, 0.5 mL/dk'da çalıştırın ve ilgili proteinleri içeren her biri 0.5 mL hacimli 2-3 fraksiyon toplayın.
- Bir spin sütunu kullanarak proteinlerin her birini içeren fraksiyonları birleştirin ve konsantre edin ve Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
3. 32P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezi
- Küçük ölçekli bir Relsıralama reaksiyonunu vidalı kapaklı bir tüpe monte edin (bkz. Tablo 1).
not: Radyoaktif reaktiflerle yalnızca lisanslı bir yerde ve kişisel koruyucu ekipmanla çalışın.
- Tüpü 37 ° C'de bir termomikserde 1 saat, daha sonra 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin ve 5 dakika buz üzerine yerleştirin. Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da döndürün ve süpernatanı (sentezlenmiş 32P-ppPGpp) yeni bir vidalı kapaklı tüpe aktarın.
- 32P-pppGpp'den 32P-ppGpp sentezlemek için, 32P-pppGpp ürününün yarısını yeni bir vidalı kapaklı tüpe aktarın ve 1 μM GppA ekleyin. Tüpü 37 ° C'de 10 dakika, 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin ve ardından 5 dakika buz üzerine yerleştirin.
- Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da döndürün ve süpernatanı (sentezlenen 32P-ppGpp) yeni bir vidalı kapaklı tüpe aktarın.
- 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp'yi, 1.5 M KH 2 PO4, pH 3.4 kullanarak ince tabaka kromatografisi (TLC) plakası (polietilenimin ile modifiye edilmiş selüloz TLC plakaları) üzerinde 1 μL çalıştırarak analiz edin.
not: Kontrol olarak α-32P etiketli guanozin 5'-trifosfat (32P-α-GTP) kullanın.
- TLC plakasını tamamen kurulayın, şeffaf plastik bir klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir saklama fosfor ekranına maruz bırakın. Bir fosfor görüntüleyici kullanarak sinyalleri görselleştirin ve nicelleştirin.
not: 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp oranları %85'ten yüksek olduğunda, Tablo 1 kullanılarak büyük ölçekli bir reaksiyon (500 μL, 20 96 oyuklu plakayı taramak için yeterli) birleştirilebilir ve sentezlenebilir.
4. (p)ppGpp'nin hedef proteinlerinin DRaCALA taraması
- 20 μL tam hücre lizatını çözün ve 96 oyuklu bir V-tabanlı mikrotitre plakasına aktarın. Serratia marcescens'ten 2.5 U / kuyu endonükleaz ekleyin ve lizat viskozitesini azaltmak için 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Lizatları 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
- 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp'yi 1: 1 oranında karıştırın ve (p) ppGpp'nin nihai konsantrasyonunu 4 nM.
'ye eşit yapmak için 1x lizis tamponu L1 ekleyin
not: pppGpp ve ppGpp arasındaki kimyasal benzerlik göz önüne alındığında, her iki kimyasalın bir karışımı tarama sürecini basitleştirecektir.
- 10 μL (p)ppGpp karışımını hücre lizatı ile eklemek ve karıştırmak için çok kanallı bir pipet ve filtrelenmiş pipet uçları kullanın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
- 96 x pimli aleti 30 saniye boyunca %0,01'lik bir iyonik olmayan deterjan çözeltisine koyarak yıkayın ve kağıt mendil üzerinde 30 saniye kurutun. Pim aletinin yıkamasını 3x tekrarlayın.
- Pim aletini yukarıdaki 96 oyuklu numune plakalarına yerleştirin ve 30 saniye bekleyin. Pim aletini düz bir şekilde yukarı kaldırın ve 30 s.
için düz bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirin
not: Bir nokta eksikse, karşılık gelen numunelerden 2 μL'yi bir pipet ve filtrelenmiş uçlarla tespit edin. Aşağıda belirtildiği gibi aynı numunenin bir kopyasının yapılması tavsiye edilir.
- Membranı RT'de 5 dakika kurutun. Membranı şeffaf plastik bir klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Bir fosfor görüntüleyici kullanarak görselleştirin.
5. Potansiyel hedef proteinlerin miktar tayini ve tanımlanması
- Görselleştirilmiş plakaların .gel dosyasını açmak için fosfor görüntüleyici ile ilişkili analiz yazılımını kullanın. 12 sütun x 8 satırdan oluşan bir ızgara ayarlayarak 96 noktayı tanımlamak için Dizi analizi işlevini kullanın.
- Tüm noktaların dış kenarını çevrelemek için büyük daireler tanımlayın (bkz. Şekil 1). Tanımlanan büyük dairelerin Volumn+Background ve Area'sını dışa aktarın ve bir elektronik tabloya kaydedin.
not: Gerekirse, her bir daireyi noktalarla mükemmel bir şekilde örtüşecek şekilde yeniden konumlandırın ve her bir daireyi gerçek noktadan biraz daha büyük olacak şekilde yeniden boyutlandırın.
- Küçük iç noktaları çevrelemek için tanımlanan daireleri küçültün. Tanımlanan küçük dairelerin Volumn+Background ve Area değerlerini dışa aktarın ve bir elektronik tabloya kaydedin.
- Şekil 1'deki denklemi kullanarak elektronik tablodaki bağlayıcı kesirleri hesaplayın ve verileri çizin. Diğer kuyucukların çoğuna kıyasla yüksek bağlanma fraksiyonları gösteren kuyucuklardaki potansiyel bağlayıcı proteinleri tanımlayın.
Tablo 1: 32P etiketli pppGpp'nin küçük ve büyük ölçekli sentez reaksiyonları için bilgi birleştirme. *10x Relseq tamponu 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2 içerir. Kısaltma: pppGpp = guanozin pentafosfat.
| Hacim (μL) |
| Küçük ölçekli | Büyük ölçekli |
| Ultra saf su | | |
| 10x Relseq tamponu* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM finali) | | |
| Relseq (4 μM finali) | | |
| 32P-α-Guanozin trifosfat (GTP) (son 120 nM) (DİKKAT) | 0,2 | 5 |
| toplam | 20 | 500 |
