Floresan Prob Görüntüleme Testi: Reaktif Oksijen Türleri İndükleyici ile Tedavi Edilen Kültürlenmiş Bağırsak Organoid Hücrelerinde Oksidatif Stresi Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Stedman, A. ve diğerleri, Reaktif Oksijen Türüne Duyarlı Florojenik Prob Kullanarak Murin Bağırsak Organoidlerinde Oksidatif Stresin Analiz Edilmesi. J. Vis. Exp. (2021).

Bu videoda, kültürlenmiş organoidlerde oksidatif stresi görselleştirme tekniği açıklanmaktadır. Bu çalışma, farklı ROS modülatörleri ile tedaviden sonra bir organoidde bulunan çeşitli hücre tiplerinde ROS birikimine bağlı oksidatif stres seviyesinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Protokol

1. 3D organoidlerde oksidatif stresin konfokal mikroskopi ile görselleştirilmesi

1. μ-Slide 8 kuyucuklu haznede kaplanmış organoidleri alın ve 1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için ilgili oyuklara 1 μL N-asetil sistein veya NAC stok çözeltisi ekleyin.
2. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 1 saat inkübe edin.
3. 200 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyucuklara 1 μL tBHP stok çözeltisi ekleyin.
4. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin.
5. 5 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için florojenik probun 1.25 mM seyreltmesinin oyuğu başına 1 μL ekleyin.
6. 5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için Hoechst'in 1.25 mg / mL seyreltmesinin oyuğu başına 1 μL ekleyin.
7. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin.
8. BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın. Nazikçe, fenol kırmızısı içermeyen 250μL ılık DMEM ekleyin.
   not: Uzun vadeli bir satın alma planlanıyorsa, fenol kırmızısı içermeyen DMEM'e büyüme faktörleri bileşikleri ekleyin.
9. Florojenik probu (ROS) algılayan bir termik oda ve gaz kaynağı ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanarak organoidleri görüntüleyin.
   not: Florojenik prob için uyarma/emisyon (ex/em) 644/665, Hoechst (çekirdekler) için ex/em 361/486 ve GFP (Lgr5-GFP farelerinden alınan bağırsak kök hücresi) için ex/em 488/510'dur. Kök hücrelerdeki sinyalleri tespit etmek için 63x yağa daldırma objektifi kullanılır. Numuneler arasında lazer ayarlarını değiştirmeyin. ROS üretimine genel bir bakış sağlamak için 20x'lik bir hedef kullanılabilir.
10. ROS sinyali için lazer yoğunluğunu ve zamana maruz kalmayı ayarlamak için pozitif kontrolü kullanın ve negatif kontrolde bu sinyalin daha düşük olduğunu kontrol edin.
11. Göz merceğini kullanarak, ifade eden GFP organoidlerini tanımlamak ve lazer yoğunluğunu ayarlamak için slaydı tarayın.
    not: Bu adım manuel olarak gerçekleştirilir.
12. Tüm organoidin dikişli bir görüntüsünü elde etmek için pozisyonları tanımlayın. Organoidlerin bir hücre katmanını gösteren bir bölümünü elde etmek için 25 μm'lik (adım boyutu 5 μm) bir z-yığını ayarlayın.
    not: Kurulumu optimize etmek için mikroskop kullanım kılavuzuna bakın. Canlı hücreler kullanılarak, inkübasyonun bitiminden sonraki 1 saat içinde edinim yapılmalıdır.
13. Görüntüleri açık kaynaklı bir görüntü işleme yazılımında açın (bkz.
14. Z-yığınından geçin ve organoidlerin ortasının iyi temsil edildiği bölümü seçin ve seçilen alanla yeni bir görüntü oluşturun.
15. Görüntüleri aşağıdaki adımlara göre ölçün.
    1. Serbest çizgi aracını seçin.
    2. Çekirdeği takip eden bir çizgi çizin.
       not: Sadece kök hücreler analiz ediliyorsa, sadece GFP pozitif hücreler sunan bölgeleri seçin.
    3. Luminal kalıntıyı dahil etmeden hücre katmanını çizgiyle kaplamak için çizgi genişliğini artırın.
    4. ROS sinyali için kanalı seçin ve seçilen bölgedeki floresan yoğunluğunu ölçün ve değerlere açıklama ekleyin.
    5. Sinyalin olmadığı bir çizgi çizin ve son yoğunluğu elde etmek için önceki değerden çıkarılacak olan arka planın floresan yoğunluğunu ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	Jackson Laboratuvarı
Büyüme kültürü ortamı
İleri Düzey DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	12634010
Penisilin-Streptomisin (P/S)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	15140122	Stok Konsantrasyonu: 100x (10.000 ünite/mL penisilin ve 10.000 μg/mL streptomisin)
FLuoroBrite DMEM (DMEM fenol kırmızısı içermez)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	H3570	10 mg / mL'de stok
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış, Fenol Kırmızısı İçermez (Bazal Membran Matrisi)	Corning	356231	alındıktan sonra buzdolabında çözülür, buzda 1 saat bekletilir, 500 mL alikot yapılır ve -20 °C'de saklanır
μ-Slide 8 Kuyu odaları	İbidi	80826
N-asetilsistein (NAC)	Sigma	A9165
tert-Bütil hidroperoksit (tBCHP) çözeltisi (ağırlıkça %70. H2O2 içinde)	Sigma	458139
Programlar ve Ekipmanlar
Fiji/GörüntüJ			https://imagej.net/software/fiji/ indirmeleri görüntü oluşturma
Gözlemci.Z1	Zeiss		konfokal sistem
Opterra (süpürülmüş alan konfokal)	Bruker		konfokal sistem
yüksek hızlı EMCCD Kamera Evolve Delta 512	Fotometri		konfokal sistem
prizma	GraphPad Yazılımı		İstatistiksel Analiz