Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Bağırsak organoidlerinin kültürlenmesi için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
- Büyüme kültürü ortamını hazırlamak için, 1x glutamin, 1x penisilin / streptomisin (P / S) çözeltisi, 10 mM HEPES, 50 ng / mL murin EGF, 20 μg / mL murin Noggin 500 ng / mL fare R-Spondin1 ile takviye edilmiş gelişmiş DMEM / F-12'yi karıştırın (bkz. Kriptin çıkarılması sırasında ortamı oda sıcaklığında (RT) bırakın.
not: Kullanılmayan ortamı -20 °C'de alikotlarda dondurun. Donma ve çözülmeyi önleyin.
- 50 mL'lik bir tüpü 40 mL Gelişmiş DMEM/F-12 ile doldurun ve buz üzerinde tutun.
not: Kullanılmayan ortamı 4 °C'de tutun. Organoid pasaj için kullanılacaktır.
- Hücre kültürü plakalarını (96 oyuklu yuvarlak alt) inkübatörde 37 °C'de önceden ısıtın.
- Buzda bazal membran matrisini (BMM) (Malzeme Tablosuna bakınız) çözün (protokole başlamadan önce veya kriptleri kaplamadan en az 1 saat önce).
not: BMM, soğuk tutulmazsa hızla katılaşacaktır.
- DPBS'ye (DPBS-P/S) %1 penisilin-streptomisin solüsyonu ekleyerek yıkama / yıkama solüsyonu hazırlayın.
- 100 mm'lik bir petri kabını 10 mL soğuk DPBS-P/S ile doldurun. Altı adet 15 mL'lik tüpü 10 mL DPBS ile doldurun ve bunları F1'den F6'ya kadar etiketleyin.
- DPBS'de 0.5 M EDTA'dan seyrelterek 30 mL 10 mM EDTA çözeltisi hazırlayın. İki adet 15 mL'lik tüpü 10 mL 10 mM EDTA ile doldurun ve bunları E1 ve E2 olarak etiketleyin.
- Tüm çözeltileri 4 ° C'de önceden soğutulmuş halde tutun ve işlem sırasında buz üzerinde tutun.
2. Bağırsak organoidleri kültürü
- 8-10 haftalık bir Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) fareyi ulusal kural ve düzenlemelere göre kurban edin.
- Duodenum (mideden 5 cm) ve ileum (çekumdan 10 cm) arasındaki bölgeyi kapsayan jejunumun 5-8 cm'sini toplayın ve buz üzerinde soğuk DPBS-P/S'de tutun.
- Bağırsak içeriğini 5-10 mL soğuk DPBS-P/S.
ile yıkayarak temizleyin
not: Ev yapımı yıkama şırıngaları, 200 μL'lik bir ucu 10 mL'lik bir şırınga ağzına takarak elde edilebilir.
- Bilyeli makas kullanarak bağırsağı uzunlamasına açın (dokuya zarar vermemek için) Malzeme Tablosuna bakınız).
- Forseps kullanarak, dokuyu oda sıcaklığında soğuk DPBS-P/S içeren bir petri kabına aktarın ve durulamak için çalkalayın.
- Plastik bir Pasteur pipeti ile bağırsağı aspirasyon ile tutun ve 10 mL soğuk 10 mM EDTA içeren E1 etiketli 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 3 kez ters çevirin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak, dokuyu 10 mL DPBS içeren F1 tüpüne aktarın. 2 dakika boyunca girdap yapın (normal girdapta, tüpü elle tutun ve bağırsağın güzelce dönmesini sağlayın).
- Fraksiyonun 10 μL'sini bir petri kabına koyun ve fraksiyonun kalitesini mikroskop altında değerlendirin.
not: Tüm girdap adımları maksimum hızda gerçekleştirilir ve her bir fraksiyonun kalitesi mikroskop altında değerlendirilmelidir (Şekil 1).
- Plastik bir Pasteur pipeti ile bağırsağı aspirasyon ile tutun ve 10 mL DPBS içeren F2 tüpüne aktarın ve 2 dakika boyunca girdap yapın.
- Adım 2.10'u tekrarlayın, dokuyu 10 mL DPBS içeren F3 tüpüne aktarın ve 2 dakika boyunca girdap yapın.
- EDTA inkübasyonunu adım 2.6'daki gibi tekrarlayın ve dokuyu 10 mM EDTA içeren tüp E2'ye aktarın.
- Tüpü 3 kez ters çevirin ve 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Adım 2.10'u tekrarlayın, dokuyu 10 mL DPBS içeren F4 tüpüne aktarın ve 3 dakika boyunca girdap yapın.
- Dokuyu 10 mL DPBS içeren F5 tüpüne aktararak ve 3 dakika boyunca girdap yaparak 2.14 adımını tekrarlayın.
- Dokuyu 10 mL DPBS içeren F6 tüpüne aktararak ve 3 dakika boyunca girdap yaparak 2.15 adımını tekrarlayın.
- Villus ve önemli kalıntıları ortadan kaldırmak için 70 μm'lik bir hücre süzgecinden yerçekimi ile filtrelenen en iyi fraksiyonları 50 mL'lik bir tüpe (buz üzerinde) birleştirin.
not: Genellikle, F5 ve F6, çok sayıda kript ve daha az enkaz içeren fraksiyonlardır.
- Kriptoları 150 x g'da 4 °C'de 3 dakika döndürün.
- Tüpü boşaltın, peleti mekanik olarak parçalayın ve 5 mL soğuk DMEM/F12 ekleyin.
- 10 μL süspansiyonu bir petri kabına koyun ve alikotta bulunan kriptlerin sayısını mikroskop altında manuel olarak sayın.
not: Tek hücreleri veya küçük kalıntıları saymayın.
- Kuyu başına 300 kriptin kaplandığını, W'nin kuyu sayısı olduğunu ve N'nin süspansiyonun 10 μL'sinden sayılan kript sayısı olduğunu göz önünde bulundurarak, μL cinsinden gerekli kript süspansiyonunun hacmini (V) hesaplayın. Kriptleri 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
not: V = 300 x G x 10/N. Planlanan deneyde küçük bir hacim kullanılıyorsa, 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanılabilir.
- Kriptoları 200 x g'da 4 °C'de 3 dakika döndürün.
- Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın.
- Peleti mekanik olarak parçalayın ve 90 kript/μL'lik bir konsantrasyon elde etmek için yavaşça büyüme kültürü ortamı ekleyin.
- 30 crypt / μL'lik bir nihai konsantrasyona sahip olmak için 2 hacim seyreltilmemiş BMM ekleyin. Karışıma hava kabarcıkları sokmadan dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: BMM katılaşmasını önlemek için tüpü daima buz üzerinde tutun.
- Her bir kuyucuğa 10 μL kript / BMM karışımı plakası. Akış sitometrisi analizi için yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakalar kullanın. Her kuyucuğun ortasına 10 μL'yi bir kubbe olarak dağıtın.
not: Derinlemesine görüntülemelerini sağlamak için görüntüleme tahlili için organoidleri ince bir tabaka halinde plakalayın.
- BMM'nin katılaşmasına izin vermek için plakayı RT'de 5 dakika bekletin. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de 15 dakika inkübatöre yerleştirin.
- BMM'yi ayırmamaya dikkat ederek her bir oyuğa 250 μL büyüme ortamı ekleyin.
- Plakaları 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
- ROS analizini kültürün 4. ve 6. günleri arasında gerçekleştirin. Aksi takdirde, ortamı değiştirin ve birkaç uzun tomurcuklanan yapının ortaya çıkmasından sonra ve ölü hücreler organoidlerin lümenlerinde biriktikten sonra organoidleri ayırın.
3. Organoidlerin geçmesi
- Kültürün 6. gününden itibaren, önemli tomurcuklanma yapılarının oluştuğu ve organoidlerin lümenlerinin koyulaştığı ince bağırsak organoidlerini geçirmeye başlayın.
not: Organoidin lümeni, ölü hücrelerin, döküntülerin ve mukusun birikmesi nedeniyle kararır. Ayrılmadan önce organoidlerin aşırı büyümesine izin vermekten kaçının. Bölünme oranı organoidlerin büyümesine bağlıdır. Organoidlerin 6. günde 1: 2 ve 10. günde 1: 3 oranında geçirilmesi önerilir.
- 15 mL'lik bir tüpü 4 mL soğuk Advanced DMEM/F-12 ile doldurun ve buz üzerinde tutun.
not: Burada, 96 oyuklu bir kültür plakası için hacimler sağlanmıştır. Farklı bir format kullanılıyorsa, ses seviyesini buna göre ayarlayın.
- Ortamı, BMM kubbelerine dokunmadan kuyulardan bir pipet veya vakum pompası ile dikkatlice aspire edin ve atın.
- Kuyucuk başına 100 μL soğuk Gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin. BMM'yi kırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve kuyu içeriğini 15 mL'lik tüpe aktarın.
- Kuyuyu 200 μL soğuk Advanced DMEM/F-12 ile yıkayın ve aynı tüpte toplayın.
not: Aynı deney koşulundan birden fazla kuyu geçiyorsa, kuyucukların içeriği aynı 15 mL toplama tüpünde toplanabilir.
- 15 mL toplama tüpünü 100 x g'da 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
- Süpernatanı atın ve pelete 1 mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. Bir P1000 ucu kullanarak, bir P10 ucu (filtresiz) alın ve en az 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Tüpe 4 mL soğuk Gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin. 300 x g'da 4°C'de 5 dakika döndürün.
- Süpernatanı, peleti bozmadan bir pipet veya vakum pompası ile aspire edin. Sonra, peleti mekanik olarak parçalayın.
- Büyüme kültürü ortamında (2: 1 oranında) seyreltilmiş BMM ekleyin. Karışıma hava kabarcıkları eklemeden dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Her bir kuyucuğa 10 μL kript / BMM karışımı plakası.
- BMM'nin katılaşmasına izin vermek için plakayı RT'de 5 dakika tutun. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de 15 dakika inkübatöre yerleştirin.
- Her kuyucuğa 250 μL büyüme ortamı ekleyin.
not: BMM'yi sökmemeye dikkat edin.
- Plakaları 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
4. Bağırsak organoidlerinde oksidatif stresi değerlendirmek için reaktiflerin ve materyallerin hazırlanması
- 250 mM'lik bir inhibitör N-asetilsistein (NAC) stok çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 245 μL DPBS ile 10 mg'ı yeniden süspanse edin. 1 mM nihai konsantrasyonda kullanın.
- % 70 su içinde 50 mM'lik bir indükleyici Tert-bütil hidroperoksit (tBHP) stok çözeltisi hazırlayın ve 3.22 μL'yi 496.8 μL DPBS ile seyreltin. 200 μM nihai konsantrasyonda kullanın.
- Akış sitometrisi çalışması için, stok çözeltisini DMSO'da 1/10 oranında seyrelterek 250 μM'lik bir florojenik prob çalışma çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 1 μM nihai konsantrasyonda kullanın.
not: Üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi, florojenik prob ışığa ve oksijene duyarlıdır. Stoklar ve alikotlar çok fazla açılıp kapatılmamalıdır.
- Flow sitometri testinde ölü hücre ayrımı için kullanılmak üzere DPBS'de 0.1 μg / mL DAPI'lik nihai bir çözelti hazırlayın.
not: Bu adımlar, Şekil 2A'da belirtilen koşulları kullanarak herhangi bir tahlilde dahil edilmesi gereken negatif ve pozitif kontrollerin kullanımını açıklar. Tahlil, anti- veya pro-oksidan bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Adımlar aynıdır ve tek fark, florojenik boya kullanılmadan önce bileşiklerin eklenmesidir.
5. Akış sitometresi kullanılarak ayrışmış organoidler üzerindeki oksidatif stresin ölçülmesi
- 1 mM.
'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için negatif kontroller için kuyucuklara 1 μL NAC stok çözeltisi ekleyin
not: 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalarda kaplanmış organoidleri kullanın.
- 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
- 200 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyucuklara 1 μL tBHP stok çözeltisi ekleyin.
- 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.
- Çok kanallı bir pipetle, ekli BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın ve başka bir 96 oyuklu yuvarlak alt plakaya aktarın. Bu tabağı bir kenara koyun.
- 100 μL tripsin ekleyin ve çok kanallı bir pipetle, BMM'yi yok etmek için en az beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- 37 ° C ve% 5 CO2'de en fazla 5 dakika inkübe edin.
- Çok kanallı bir pipetle, organoidleri ayırmak için en az beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Plakayı ters çevirerek süpernatanı atın. Adım 6.3'te toplanan besiyerini ilgili kuyucuklara geri ekleyin ve 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.
- 250 μM seyreltmeden oyuk başına 1 μL ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve% 5 CO2.
not: Florojenik probu, cihazın ayarları için gerekli olan kuyucuklara eklemeyin (Şekil 2B).
- RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Hücreleri 250 μL 0.1 μg / mL DAPI çözeltisi ile yeniden süspanse edin. Numuneleri uygun Flow sitometri tüplerine aktarın, tüpleri buz üzerinde tutun ve analize devam edin.
not: Cihazın ayarları için gereken kuyucuklara DAPI yerine PBS ekleyin (Şekil 2B).
- Tek lekeli numuneler kullanarak her florofor için lekesiz kontrol ve lazer voltajlarında ileri ve yan saçılma voltajı ayarlarını optimize edin.
- Uygun bir geçit stratejisi kullanarak (Şekil 3A), en az 20.000 olay toplayın.
NOT: 50.000 etkinlik tercih edilir. Ayrıntılı alım ayarları, kullanılan cihaza göre değişir.
