1. Bakulovirüs Ekspresyon Yapılarının Hazırlanması
- K-bZIP'in cDNA'sını bir N-terminal epitop etiketi ile çift ekspresyonlu bir bakulovirüs vektörüne (Malzeme Tablosuna bakınız) klonlayarak SUMO E3 ligaz K-bZIP'i saflaştırın. Bir oktapeptid etiketi kullanarak başarılı olduk (protokol boyunca vector-tag-K-bZIP olarak gösterilir).
not: K-bZIP polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) klonlaması için DNA şablonu, doksisiklin tedavisini takiben TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 hücrelerinden izole edilen RNA'dan ters kopyalanan cDNA'dır.
- Tam uzunluktaki K-bZIP cDNA'yı CpoI klonlama bölgeleri ile ikili ekspresyon vektörüne aktarın. CpoPCR ürününü ve 1 μg ikili ekspresyon vektörünü 37 °C'de 3 saat boyunca sindiririm.
- % 0.8'lik bir agaroz jel üzerinde elektroforezi takiben sindirilmiş DNA'yı ayırın ve çıkarın. Ek parçayı (K-bZIP) ve vektörü T4 DNA ligaz ile 16 °C'de üreticinin talimatlarına göre 30 dakika boyunca bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- 1.5 mL'lik bir tüpte 50 μL yetkin E. coli hücresi "A"ya (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 μL ligasyon DNA'sı ekleyin. 30 dakika buza koyun. Ardından, 1,5 mL'lik tüpü 42 °C'lik bir su banyosunda 45 saniye inkübe edin ve tüpü hemen 3 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
- 600 μL S.O.C. orta (%0.5 (a/h) maya özütü, %2 (a/h) tripton, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM MgSO4 ve %4 (a/h) glikoz) tüpe ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Ardından, tüpü oda sıcaklığında 600 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın, peleti 60 μL Luria-Bertani ortamı (LB; %1 (a/h) tripton, %0.5 (a/h) maya özütü ve 85 mM NaCl) ile yeniden süspanse edin ve 100 μg/mL ampisilin içeren LB agar plakalarına yayın. Agar plakasını 37 °C'de 16 saat inkübe edin.
- 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamda aşılamak için 1 kolon seçin ve 37 ° C'de 16 saat boyunca 250 rpm çalkalama ile kültürleyin. Ardından, plazmidi, vektör-tag-K-bZIP'i, üreticinin talimatlarına göre bir plazmit ekstraksiyon kiti ile çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Vektör-etiketi-K-bZIP'in yetkin E. coli hücreleri "B"ye dönüştürülmesiyle etiket-K-bZIP'i barındıran rekombinant bacmid'i oluşturun (bkz. Malzeme Tablosu).
- 0.2 μg vektör-etiket-K-bZIP plazmidi ve 100 μL yetkin E'yi karıştırın. 1.5 mL'lik bir tüpte koli hücreleri "B" ve 30 dakika boyunca buza koyun. Tüpü 42 ° C'lik bir su banyosunda 45 saniye inkübe edin ve tüpü hemen 3 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
- Tüpe 900 μL S.O.C. ortamı ekleyin ve 50 rpm'de dönerek 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. Daha sonra, ortamdan 10 μL alın ve 50 μg/mL kanamisin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL galaktosidaz substratı ve 40 μg/mL izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) içeren LB agar plakalarına yaymak için 50 μL daha SOC ortamı ekleyin, ve plakaları 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- Bir beyaz koloniyi 50 μg/mL kanamisin, 7 μg/mL gentamisin ve 10 μg/mL tetrasiklin içeren 5 mL LB ortamda aşılayın. 37 °C'de 250 rpm ile 16 saat çalkalayarak inkübe edin.
- Tag-K-bZIP'i barındıran rekombinant bacmid DNA'sını izole edin, miktarını belirleyin ve 1 μg/μL'lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- Tag-K-bZIP içeren 1 μg rekombinant bacmid DNA'yı 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunda Sf9 hücrelerine transfekte ederek tag-K-bZIP eksprese eden rekombinant bakulovirüsler oluşturun.
- 2 mL Grace'in Böcek Ortamında 2 x 106 Sf9 hücresi (Malzeme Tablosuna bakınız), 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 gentamisin ile birlikte verilir, daha sonra 27 ° C'de 1 saat inkübe edilir.
- 140 rpm'de orbital süspansiyonda 27 ° C'de %10 FBS, %1 gentamisin ve %1 deterjan C (Malzeme Tablosuna bakınız) ile sağlanan Grace'in Böcek Ortamında Sf9 hücrelerinin log faz kültürünü koruyun. Bir hemositometre ve tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın; Hücre canlılığı% 95'i geçmelidir. Her 2-3 günde bir 1: 3'lük bir alt kültivasyon oranı kullanarak hücreleri koruyun (minimum yoğunluk ~ 0.5 x 106 hücre / mL).
- 2 mL'lik bir tüpe 2 μL bakmid DNA (1 μg/μL) ve 98 μL indirgenmiş serum ortamı (Malzemeler Tablosuna bakınız) ekleyin. Daha sonra, tüpe 4 μL transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Bu transfeksiyon karışımını (104 μL) her bir oyuğa ekleyin ve 27 ° C'de 12-16 saat inkübe edin.
- Biten ortamı hafif aspirasyonla çıkarın ve %10 FBS ve %1 gentamisin ile sağlanan 2 mL taze Grace's Insect Medium ile değiştirin. Sf9 hücreleri plaka yüzeyine gevşek bir şekilde yapışır ve nazik aspirasyon ile rahatsız edilmez.
- Transfeksiyondan sonra rekombinant bakulovirüsü toplayın ve daha ileri deneyler için yüksek titreli stoklar (P1) elde etmek için bakulovirüsü çoğaltın.
- Ortamı değiştirdikten 72 saat sonra, steril bir hücre kaldırıcı kullanarak Sf9 hücrelerini kazıyın, süpernatanı her bir kuyucuktan 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın ve 10 saniye boyunca girdaplayın.
- 4 ° C'de 3 dakika boyunca 150 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı P0 bakulovirüs ve alikot olarak 1.5 mL tüplerde toplayın (her tüpte 1 mL bakulovirüs). -80 °C'de saklayın.
- 10 mL Grace's Insect Medium'da 1 x 10 7 Sf9 hücresi tohumlayın, 10 cm'lik bir Petri kabında %10 FBS ve %1 gentamisin ile beslenin ve 27 °C'de 1 saat inkübe edin.
- tag-K-bZIP eksprese eden rekombinant bakulovirüslerin amplifikasyonu için, tohumlanmış Sf9 hücrelerine 0.5 mL P0 bakulovirüs ekleyin ve 27 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- Süpernatanı 15 mL'lik bir tüpte P1 bakulovirüs olarak toplayın ve 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
2. K-bZIP'in saflaştırılması
- Adım 9'da açıklandığı gibi 10 rpm'de yörünge süspansiyonunda 10 °C'de %1 gentamisin ve %1 deterjan C ile sağlanan Grace'in Böcek Ortamında 140 rpm'de 1.3.2 hücrelerinin log faz kültürünü koruyun.
- Transdüksiyon gününde, 2 x 106 hücre / mL yoğunluğa sahip 250 mL Sf9 hücresine 1 mL bakulovirüs içeren süpernatan (P1) ekleyin.
- Sf9 hücrelerini 140 rpm çalkalama ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 27 ° C'de 72 saat inkübe edin, daha sonra 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2.740 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Süpernatan ve liz hücresi peletlerini 10 mL lizis tamponunda (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, %1 deterjan A (Malzeme Tablosuna bakınız), %2 gliserol, proteaz inhibitör kokteyli) çıkarın ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de bir süspansiyon karıştırıcı kullanarak 50 rpm'de döndürün.
- Süpernatanı toplamak için 15.000 x g'da 15 dakika santrifüj hücresi lizatını yapın.
- Tag-K-bZIP'i saflaştırmak için, hücre lizatlarını (10 mL) 14 mL polipropilen tüplerde 50 μL antikor etiketli manyetik boncuklarla inkübe edin ve bir süspansiyon karıştırıcı kullanarak 4 ° C'de 3 saat boyunca 50 rpm'de döndürün. Protein yakalamanın ardından, boncukları 4 ° C'de 30 saniye boyunca 800 x g santrifüjde peletleyin. Süpernatantın çoğunu çıkarın, boncukları yaklaşık 1 mL'lik kalan hacimde yeniden askıya alın ve yıkama için 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Boncukları içeren tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirerek yakalanan proteini yıkayın ve manyetik boncuklar tüpün yan tarafına tamamen yapıştıktan sonra süpernatanı çıkarın.
- Boncukları lizis tamponu ile dört kez yıkayın.
- 1.5 mL'lik tüplere 1 mL lizis tamponu ekleyin ve tüpleri 10 kez ters çevirin. 1.5 mL'lik tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatanı 2.7'de açıklandığı gibi çıkarın.
- Önceki adımı 3 kez daha tekrarlayın.
- Boncukları fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkayın.
- 1.5 mL tüplere 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4) ekleyin ve tüpleri 10 kez ters çevirin.
- 1,5 mL'lik tüpü manyetik bir stand üzerine koyun ve ardından süpernatanı çıkarın.
- PBS içinde seyreltilmiş 100 μL 150 μg/mL oktapeptidi 1.5 mL'lik bir tüpe ekleyerek antikor etiketli manyetik boncuklardan tag-K-bZIP proteinini elute edin. Tüpü oda sıcaklığında bir süspansiyon karıştırıcı ile 50 rpm'de 10 dakika döndürün. Ardından, tüpü manyetik standa geri yerleştirin ve K-bZIP içeren süpernatanı 1,5 mL'lik temiz bir tüpte toplayın.
- 1-5 μL saflaştırılmış tag-K-bZIP proteinini SDS-PAGE ile analiz edin ve ardından Coomassie mavisi boyayın. Aynı jel üzerine 2 μg, 1 μg ve 0.5 μg sığır serum albümini (BSA) numuneleri yükleyin ve ImageJ gibi bir görüntü işleme programı ile miktar tayini için kullanın. BSA standartlarıyla karşılaştırarak K-bZIP konsantrasyonunu tahmin edin.
- Saflaştırılmış K-bZIP artık her bir SUMOylation testinde kullanılmaya hazırdır. K-bZIP'i PBS'de 100 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve -80 ° C'de küçük alikotlarda saklayın.
3. SUMOylation Deneyi
- Her in vitro SUMOylation reaksiyonunun ana karışımına 3 μL 100 ng/μL saflaştırılmış tag-K-bZIP ekleyin. Ana karışımdaki bileşenler 1 μL protein tamponu, 1x SUMOylation tamponu, 0.5 μL p53 proteini (0.5 mg/mL), 25 nM E1 aktive edici enzim (stok konsantrasyonu: 1 μM), 50 nM E2 konjuge edici enzim (stok konsantrasyonu: 10 μM) ve SUMO peptitlerinin her biri (SUMO-1, SUMO-2 veya SUMO-3; stok konsü.: 5 μM) 17 μL'lik bir nihai hacme kadar.
- İçeriği nazikçe karıştırın ve reaksiyonu 30 ° C'de 3 saat inkübe edin. 20 μL 2x SDS-PAGE yükleme tamponu (100 mM Tris-HCL pH 6.8,% 4 sodyum dodesil sülfat,% 0.2 (a / h) bromofenol mavisi,% 20 (h / h) gliserol ve 200 mM β-merkaptoetanol) ekleyerek reaksiyonu durdurun ve numuneleri 95 ° C'de 5 dakika boyunca denatüre edin.
- SDS-PAGE üzerinde ayrı numuneler, ayrılan proteinleri yarı kuru bir elektroforetik transfer aparatı kullanarak PVDF membranına aktarın ve anti-p53 antikoru kullanarak Western blot ile analiz edin.
- Jel aparatını kurun ve 20 μL numuneyi jel kuyularına yükleyin.
- %10'luk jeli yaklaşık 120 dakika boyunca 80 V'ta sabit bir akımda çalıştırın (boya bandı jelin dibine ulaşana kadar). Elektroforez tamamlandıktan sonra, güç kaynağını kapatın.
- Jeli çıkarmak için jel aparatını ve jel kasetlerini ayırın ve jeli 5 dakika boyunca yarı kuru transfer tamponuna (48 mM Tris-HCl, 39 mM glisin, %20 metanol) daldırın.
- Başka bir kap alın ve PVDF membranını 1 dakika metanol içinde bekletin. Ardından, PVDF'yi metanolden çıkarın ve yarı kuru transfer tamponuna koyun. Membranı 5 dakika boyunca nazikçe çalkalayın.
- Yarı kuru elektroforetik aparatın güvenlik kapağını çıkarın.
- Filtre kağıdını önceden ıslatın ve alt platin anot üzerinde aşağıdaki gibi bir jel sandviç hazırlayın: filtre kağıdı, PVDF membranı, jel ve filtre kağıdı.
- Katot plakasını ve güvenlik kapağını sabitleyin, ardından lekeyi 90 dakika boyunca 15 V sabit akımda çalıştırın. Güç kaynağını kapatın, yarı kuru cihazın bağlantısını kesin ve PVDF membranını çıkarın.
- Orbital çalkalayıcı ile 30 rpm çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici tamponlu PVDF membranı (TBST tamponunda %5 yağsız süt (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, %0.1 deterjan B (bkz. Malzeme Tablosu), pH 7.6)).
- PVDF membranını, bir süspansiyon karıştırıcı kullanarak 30 rpm çalkalama ile 4 ° C'de 12-16 saat boyunca bloke edici tamponda seyreltilmiş (1: 1.000) anti-p53 antikoru ile hibritleştirin.
- PVDF membranını bir kaba alın ve TBST'ye koyun. PVDF membranı TBST ile iki kez daha durulayın.
- PVDF membranını orbital çalkalayıcı ile 30 rpm çalkalama ile 45 dakika TBST'de bekletin.
- PVDF membranını, bir süspansiyon karıştırıcı kullanılarak 30 rpm çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici tamponda (1: 4.000) seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge tavşan önleyici antikor ile hibritleştirin.
- PVDF membranını adım 3.4.10'da anlatıldığı gibi TBST ile 3 kez yıkayın.
- PVDF membranını bir süspansiyon karıştırıcı kullanarak 45 rpm çalkalayarak 30 dakika TBST'de bekletin. PVDF membranını 4 °C'de 12 saate kadar korumak için TBST'yi çıkarın ve PBS ekleyin.
- Geliştirilmiş kemilüminesan substrat (ECL substrat) reaktifi 1 ve 2'yi (1:1) karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu). PVDF membranını PBS'den çıkarın, fazla nemi emmek için bir kağıt havlu veya hafif hizmet tipi silecek ile kısa bir süre kurulayın ve hemen her bir membranın yüzeyine 3-5 dakika boyunca 400 μL ECL reaktifi ekleyin. Fazla ECL reaktifini kısa bir süre lekeleyerek çıkarın, ancak zarın tamamen kurumasına izin vermeyin.
- Bir lüminesans görüntüleme sistemi veya otoradyografi filmi kullanarak lekeyi ortaya çıkarın.