$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Reaktifin Hazırlanması
- Bir mikroplaka floresan okuyucu kullanarak tahliller için düşük floresan DMEM ortamı hazırlayın. 25 mM glikoz, 0.4 mM glisin, 0.4 mM arginin, 0.2 mM sistein, 4.0 mM glutamin, 0.2 mM histidin, 0.8 mM izolösin, 0.8 mM lösin, 0.8 mM lizin, 0.2 mM metiyonin, 0.4 mM fenilalanin, 0.4 mM serin, 0.8 mM treonin, 0.078 mM triptofan, 0.4 mM tirozin, 0.8 mM valin, 1.8 mM CaCl2, 0.81 mM MgS04, 5.33 mM KCl, 44.0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0.9 mM NaH2PO4. HCl veya NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını pH 7.4'e ayarlayın. Ortamı filtrasyon yoluyla sterilize edin.
not: Bu besiyeri, Fe(NO3)3, vitaminler ve Fenol Kırmızısı'nın ihmal edilmesi dışında yüksek glikozlu standart DMEM ortamının bileşenlerini içerir. Fenol Kırmızısı, riboflavin ve piridoksal, normal DMEM kültür ortamında, floresan sinyalinin tespitine önemli ölçüde müdahale eder. Bu bileşenlere sahip olmayan kültür ortamı, başarılı canlı hücre GFP görüntülemesi için çok önemlidir. Ortam, buzdolabında saklandığında 12 ay boyunca stabildir.
2. Floresan Mikroplaka Okuyucu Kullanılarak NLS-lusiferaz-GFP'nin Gerçek Zamanlı Bozunma Testi
- Yaklaşık 1 x 104 HeLa hücresini, şeffaf tabanlı siyah 96 oyuklu doku kültürü plakalarına tohumlayın. O / N kültüründen sonra, transfeksiyon sırasında% 50-70'lik bir birleşmeye ulaşılır.
NOT: Tamamen süspanse edilmiş HeLa hücreleri içeren 60 μl besiyeri doğrudan her bir oyuğa ekilir. Tohumlamadan sonra ileri geri ek ortam veya kaya plakası eklemeyin, aksi takdirde hücreler eşit olmayan bir şekilde dağılabilir.
- HeLa hücrelerini 0.05-0.1 μg NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmidi ile üreticinin talimatına göre transfeksiyon reaktifi kullanarak her bir oyuğa aktarın. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her kuyucuk için aliquot. Hücreli üç kuyucuk, her tedavi koşulu için arka plan floresan sinyali için kontrol görevi gören DNA ile transfekte edilmez.
not: Transfeksiyon varyasyonunu azaltmanın alternatif bir yolu, tohumlamadan önce hücreleri transfekte etmektir. Bununla birlikte, yanlış katlanmış proteinlerle transfekte edilen hücrelerin büyük bir kısmı, bu yöntem kullanılarak bağlanamaz veya azalmış canlılık gösterir. Bazı hücrelerin, toksik yanlış katlanmış proteinleri eksprese ederken tripsin sindiriminin neden olduğu strese dayanamaması muhtemeldir. Sonuç olarak, genel floresan sinyali önemli ölçüde azalır.
- Transfeksiyondan 20-24 saat sonra, canlı hücreleri 450-490 nm uyarma dalga boyuna sahip GFP ekspresyonu için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında inceleyin.
- Ortamı vakum aspirasyonu ile çıkarın. Her bir oyuğa yaklaşık 200 μl 1x PBS ekleyin ve ardından kalan DMEM ortamı miktarını çıkarmak için aspire edin.
- % 5 FBS ve 50 μg / ml CHX ile 60 μl düşük floresan DMEM ortamı ekleyin. Proteazomal bozunmayı incelemek için, bir numune setine ek proteazom inhibitörü MG132 (10 μM) ekleyin. Her tedavi / durum için üç kuyu seti ayarlayın.
not: MG132 tedavisi, proteazomal bozunma için kontrol olarak dahil edilmiştir, çünkü hücre ölümü ve floresan söndürme dahil olmak üzere floresan sinyalinin düşmesine neden olabilecek diğer faktörleri dışlamak çok önemlidir.
- CHX.
ekledikten sonra GFP'nin floresan sinyalini hemen bir floresan plaka okuyucusunda ölçün
not: Yazılım ölçüm ayarları Tablo 1'de gösterilmiştir.
- Plakayı her saat 8-10 saate kadar okuyun. Okuduktan sonra, plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.
- Verileri elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın. Floresan yoğunluğunun yanı sıra her biri için çoklu okumaların ortalama değerini kullanın. Her veri noktasının değerlerini, ilgili gruplardaki Zaman 0'ın ortalama değerlerine normalleştirin. Şekil 1A ve 1B'de ve Şekil 2, sağ panellerde gösterildiği gibi zaman içinde normalleştirilmiş floresan yoğunluğunu çizin.
- Tekrarlanan ölçümlerle iki yönlü ANOVA kullanarak iki koşul arasındaki bozulma oranlarının istatistiksel analizini gerçekleştirin.
not: Bu analizde, "floresan yoğunluğu" bağımlı değişken iken, "tedavi koşulları" ve "zaman" iki faktördür. Verileri tek tek zaman noktalarında karşılaştırmak yerine, tekrarlanan ölçümlerle iki yönlü ANOVA, tüm zaman boyunca iki tedavi grubu arasındaki farkı analiz eder.
Tablo 1: Floresan mikroplaka okuyucuda ölçüm ayarları.
| Plaka tanım dosyası | GRE96fb |
| Ölçüm modu | Floresan Yoğunluğu Alt |
| Dalga Boyu | Uyarma dalga boyu | 485 deniz mili |
| Uyarma bant genişliği | 9 deniz mili |
| Emisyon dalga boyu | 535 deniz mili |
| Emisyon bant genişliği | 20 deniz mili |
| Yanıp sönme sayısı | 5 |
| Kazanç | Kullanım kılavuzu 200 |
| >Entegrasyon süresi | 20 μs |
| Kuyu başına birden çok okuma | tür | Daire (doldurulmuş) |
| boyut | 5×5 |
| sınır | 400 μm |
