$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Tahlil protokolünün şematik bir genel bakışı Şekil 1'de verilmiştir.
1. İlk hazırlık
- Koyunlarda değerlendirme için: 8 mL serum ayırıcı pıhtı aktivatör tüplerinde kan toplayın (Malzeme Tablosuna bakınız), kan örneğini oda sıcaklığında (RT) 20-30 dakika bekletin ve ardından 15 dakika boyunca 2.100 x g'da döndürün. Tüplerin üst kısmında oluşan berrak süpernatan serumdur. Berrak sulu fazı mikrosantrifüj tüplerine alın ve -80 ° C'de saklayın
not: -80 ° C'deki serum ~ 5 yıl boyunca stabil kalır. Bilinci açık hayvanlardan alınan 16 G'lık iğne (ucu kesilmiş) ve şırınga kullanılarak karotis veninden kan alındı.
- İnaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS) 30 dakika boyunca 56 ° C'de bir su banyosuna koyarak ısıtın ve aralıklı olarak döndürün. Hassasiyet için, eşdeğer hacimde su içeren ikinci bir şişeye bir termometre yerleştirin ve FBS şişesiyle aynı anda ısı banyosuna ekleyin. Termometre 56 °C'ye ulaştığında zamanlamaya başlayın.
- Hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar için uygun aseptik teknik ve hücre kültürü uygulamasını kullanın. Kullanmadan önce tüm nesnelere ve davlumbaza %70 etanol püskürtün ve tamamlandıktan sonra %1 sodyum hipoklorit ile temizleyin.
- Yüksek glikoz (4.5 g / L) DMEM'i (% 89) ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS (% 10) ve Penisilin Streptomisin (% 1) ile birleştirerek Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) tamamlayın. Steril bir vakum filtrasyon sistemi (0,22 μm gözenek boyutu, polietersülfon membran) kullanarak birleştirin ve filtreleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Folyoya sarılmış DMEM'in tamamını 4 °C'de saklayın.
- HT1080 hücreleri oluşturun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 75cm2'lik kare bir şişede geçiş yapın. Birden çok donmuş hücre stoğu oluşturun. 20 geçişten sonra hücreleri kullanmayın, çünkü daha fazla geçiş tahlil sonuçlarını etkileyebilir.
2. Gün 1 - Hücrelerin kaplanması
- HT1080 hücrelerini ~% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçiş.
- Tam DMEM'i (adım 1.4'te hazırlanmış),% 0.05 tripsin-EDTA ve 1x fosfat tamponlu salini (PBS) bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın. Bir aspirasyon sistemi kullanarak büyüme ortamını pasajlı hücrelerden çıkarın.
not: Bu protokoldeki tüm aspirasyonlar, steril 5 mL'lik bir serolojik pipete bağlı bir tüp ile bir vakum sistemi kullanır.
- Hücreleri 10 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS'de yıkayın ve hücreleri şişeden ayırmak için hücreleri 4 mL önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA'da 3-4 dakika tripsine edin.
- 6 mL önceden ısıtılmış tam DMEM ekleyerek tripsini inaktive edin ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Bir hemositometre ve tripan mavisi dışlama yöntemi kullanarak canlı hücrelerin sayısını ve konsantrasyonunu hesaplayın.
- Hücreleri önceden ısıtılmış tam DMEM'de 1 x 105 hücre / mL konsantrasyona seyreltin. 100 μL hücreyi/kuyuyu berrak 96 oyuklu düz tabanlı plakalara (oyuk başına 1 x 104 hücre) tohumlayın. Plakayı 37 °C'de, %5 karbondioksitte (CO2) gece boyunca 16-22 saat inkübe edin.
3. 2. Gün - Hücreleri enfekte etmek
- Plakayı/plakaları inkübatörden çıkarın ve hücrelerin kuyucuklar içinde eşit olarak dağıldığını ve birleşmenin ~%50 olduğunu doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Hücreler %45-55 birleşme aralığında değilse, '1. Gün' protokolünü tekrarlayın ve ilk hücre konsantrasyonunu buna göre ayarlayın.
- Seyreltici olarak önceden ısıtılmış tam DMEM kullanarak 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde ilgilenilen serum örneklerinin seri dilüsyonlarını oluşturun. Tablo 1, üçlü numuneler için bir seyreltme kaskadının oluşturulmasını göstermektedir.
- Testi üç kopya halinde gerçekleştirmek için, bir virüs stok çözeltisini 1x PBS'de seyrelterek 7.5 x106 vektör genomu (vg) / μL AAV6-hPLAP çalışma çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 264 μL serum / ortam seyreltmesi içeren her tüpe 66 μL 7.5 x 106 vg / μL virüs çalışma çözeltisi ekleyin (330 μL toplam hacim / seyreltme, bkz. Tablo 1).
not: Bu, mükemmel kültür koşulları gerektirmeyen sağlam bir testtir. Bununla birlikte, her bir tahlil çalışmasının doğru bir şekilde ölçülmesi ve güvenilir olduğundan emin olmak için aşağıdakilerin dahil edilmesi gerekir: (1) bir virüs ve yalnızca ortam kontrolü, (2) yalnızca ortam kontrolü ve (3) aynı deneysel koşullar altında tüm plakalarda bir NAb pozitif kontrol örneği. Açıklanan hacim (330 μL), serum ve virüs karışımının +% 10'u olan üçlü numuneleri oluşturur. Nötralize edici aktivitenin doğru bir şekilde belirlenmesi için replikaların yapılması şiddetle tavsiye edilir.
- Virüs / serum seyreltmelerini pipetleme ile karıştırın ve virüs / serum karışımlarını içeren tüpleri, potansiyel nötralizasyonun gerçekleşmesini sağlamak için 37 ° C,% 5 CO2 sıcaklıkta 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
- Her seyreltme için 1 x 104 hücre/kuyucuk içeren 96 oyuklu plakadaki her bir oyuklu kuyucuğa 100 μL virüs/serum karışımı pipetleyin.
not: Bu, her bir oyukta 15 bin virüs / hücre çokluğu (MOI) nihai viral konsantrasyonunu üretecektir. Tablo 2, numuneleri 1/512 seyreltmeye kadar değerlendirmek için örnek bir 96 oyuklu numune plakası düzeni sağlar.
- Hücreleri, serumu ve AAV-hPLAP'ı içeren 96 oyuklu plakayı folyoya sarın ve AAV'nin hücrelere girmesine izin vermek için 16-24 saat boyunca gece boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.
4. 3. Gün - Hücrelere alt tabakanın sabitlenmesi ve eklenmesi
- 1x PBS'lik bir alikotu 37 ° C'ye (~ 25 mL / 96 oyuklu plaka) önceden ısıtın. PBS'nin (~ 25 mL / 96 oyuklu plaka) ve çift damıtılmış H2O'nun (DDW, ~ 25 mL / 96 oyuklu plaka) ayrı ayrı alikotlarını 4 ° C'ye soğutun. 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde 10 mL DDW'de bir BCIP / NBT peletini (Malzeme Tablosuna bakınız) vorteksleme ile çözün (2 x 96 oyuklu plaka için 10 mL yeterlidir).
- Emme bazlı bir aspirasyon sistemine veya davlumbaz vakumuna bağlı serolojik bir pipet veya benzeri bir yöntem kullanarak ortamı 96 oyuklu plakanın kuyularından aspire edin. Serolojik pipetin ucunu nazikçe kuyucuğa yerleştirin ve yapışan hücreleri bozmamaya dikkat ederek ortamı çıkarın.
- Bir pipet kullanarak her oyuğa 50 μL RT% 4 PFA ekleyin. Plakayı folyoya sarın ve hücreleri sabitlemek için 10 dakika RT'de bırakın.
Dikkat: Paraformaldehit (PFA) olası bir kanserojendir ve cilt veya göz temasından veya solunmasından toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman ve bir yüz maskesi ile bir çeker ocak içinde tutun. PBS'de seyreltilmiş taze% 4 PFA yapın (96 oyuklu plaka başına ~ 7 mL gereklidir).
- Hücreleri 200 μL RT 1x PBS ile yıkayın ve aspire edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
not: Çok kanallı pipet, pipetleme adımları için etkili bir seçenektir.
- Her bir oyuklu içine 200 μL önceden ısıtılmış PBS pipetleyin, plakayı folyoya sarın ve endojen alkalin fosfataz aktivitesini denatüre etmek için 65 ° C'de 90 dakika inkübe edin.
- Kuyuları aspire edin ve hücreleri 200 μL soğuk (4 °C) PBS ile yıkayın. Tekrar aspire edin, 200 μl soğuk DDW'de yıkayın ve tekrar aspire edin.
- Her bir oyuğa 50 μL çözünmüş BCIP / NBT'yi (adım 4.1'de hazırlanan) pipetleyin.
- Plakayı folyoya sarın ve RT'de 2-24 h.
not: Koşular arasındaki kuluçka süresi ile tutarlı olun; Zaman esnekliği, kullanıcıların kuyuları 3. günde veya ertesi gün fotoğraflamasına olanak tanır.
- Bir ışık mikroskobu kamerası kullanarak, 4x objektif lens kullanarak her kuyucuğun fotoğrafını çekin ve gerçekleştirilen tüm tahliller için aynı pozlama, beyaz dengeleme ve ışık ayarlarının tutarlı bir şekilde kullanıldığından emin olun.
- Her kuyuyu aynı şekilde konumlandırın ve kuyu kenarlarının fotoğraflarda görünmediğinden emin olun. Fotoğrafları TIF formatında veya benzeri bir şekilde kaydedin.
not: Spesifik ayarlar mikroskoplar arasında değişecektir, ancak arka plan aydınlatması kuyular boyunca yüksek ve tutarlıysa nicelik en etkili olacaktır (Şekil 1B).
Tablo 1: Üçlü olarak serum seri dilüsyonları oluşturmak için gereken serum ve seyreltici hacimleri.
| Seyreltme kaskad etiketi | Seyreltme | 3 x örnek (240 μL) + %10 tampon hacmi (24 μL) | Serum: medya oranı |
| Seyreltme 1 (D1) | 1/2 | 264 μL serum, 264 μL ortam | 50:50 |
| Seyreltme 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL ortam | 25:75 |
| Seyreltme 3 (D3) | 1/8 | 264 μL D2 +264μL ortam | 12.5:87.5 |
| Seyreltme 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL ortam | 6.25:93.75 |
| Seyreltme 5 (D5) | 1/32 | 264 μL D4 +264 μL ortam | 3.13:96.87 |
| Seyreltme 6 (D6) | 1/64 | 264 μL D5 +264 μL ortam | 1,56:98,44 |
| Seyreltme 7 (D7) | 1/128 | 264 μL D5 +264 μL ortam | 0,78:99,22 |
| Seyreltme 8 (D8) | 1/256 | 264 μL D5 +264 μL ortam | 0,39:99,61 |
| Seyreltme 9 (D9) | 1/512 | 264 μL D7 + 264 μL ortam | 0,2:99,8 |
| Seyreltme 10 (D10) | 1/2048 | 132 μL D8 + 396 μL ortam | 0,05:99,95 |
| Seyreltme 11 (D11) | 1/8192 | 132 μL D9 + 396 μL ortam | 0,01:99,99 |
| Seyreltme 12 (D12) | 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μL ortam | 0,003:99,997 |
Tablo 2: 1/2 ila 1/512 arasında değişen seyreltmelerde saf serum örneklerini değerlendirmek için örnek 96 oyuklu plaka düzeni. AAV NAb'ler (uygulama sonrası numuneler) için pozitif olduğu bilinen bir numunenin değerlendirilmesi veya daha yüksek bir titrenin gerekli olması durumunda teste daha yüksek seyreltmeler dahil edilir. MO (-C): Yalnızca medya denetimi. VO (+C): Virüs ve yalnızca medya kontrolü. mAb: AAV'ye karşı monoklonal antikor (NAb pozitif kontrol).
| Serum örneği #1 | >Serum örneği #2 | >Serum örneği #3 | Mono AB (mAB), kontroller ve ekstra örnekler |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng
Memili | 50 ng
Memili | 50 ng
Memili |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng
Memili | 5 ng
Memili | 5 ng
Memili |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0.5 ng
Memili | 0.5 ng
Memili | 0.5 ng
Memili |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MO (-C) | MO (-C) | MO (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Sample
#1
1/512 | Sample
#1
1/512 | Sample
#1
1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Sample
#2
1/512 | Sample
#2
1/512 | Sample
#2
1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Sample
#3
1/512 | Sample
#3
1/512 | Sample
>#3
1/512 |
