$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Büyüme ortamı, ofloksasin çözeltisi ve E. coli hücre stoklarının hazırlanması
- Düzenli Luria-Bertani (LB) ortamı: Deiyonize (DI) suya 10 g / L tripton, 10 g / L sodyum klorür (NaCl) ve 5 g / L maya özü ekleyin. Ortamı otoklavlayarak sterilize edin.
- LB agar plakaları: DI suya 10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g/L maya özü ve 15 g/L agar ekleyin ve ortamı otoklavlayarak sterilize edin. İstenilen sıcaklıkta (~ 55 ° C), ~ 30 mL agar ortamını kare plakalara (10 x 10 cm) dökün. Plakaları kurutun ve 4 °C'de saklayın.
- Modifiye LB ortamı: DI suyuna 10 g / L tripton ve 5 g / L maya özü ekleyin. Ortamı otoklavlayarak sterilize edin.
- Bir ozmolit içeren modifiye LB ortamı: 2x modifiye LB ortamını eşit hacimlerde 2x ozmolit çözeltisi ile karıştırın. 2x modifiye LB ortamı hazırlamak için DI suya 20 g/L tripton ve 10 g/L maya özütü ekleyin ve otoklavlama ile sterilize edin. 2x ozmolit çözeltisini hazırlamak için, ilgilenilen ozmoliti (2x miktar) DI suyunda çözün ve ardından çözeltiyi filtreyle sterilize edin.
not: İlgilenilen ozmolit ve konsantrasyonları, Fenotip Mikrodizi tarama testlerinden belirlenebilir (bakınız Protokol 4). Bununla birlikte, test edilen ozmolit ve ilgili 2x konsantrasyonu, araştırmanın doğasına bağlı olarak ayarlanabilir. Örneğin, 1 mM sodyum klorürün etkisini incelemek için, 2x ozmolit çözeltisi 2 mM'lik bir sodyum klorür çözeltisi olacaktır.
- Ofloksasin stok çözeltisi (5 mg / mL): 1 mL DI suya 5 mg ofloksasin (OFX) tuzu ekleyin. OFX'in sudaki çözünürlüğünü artırmak için 10 μL 10 M sodyum hidroksit ekleyin ve ardından çözeltiyi filtreyle sterilize edin. Alikotları hazırlayın ve -20 °C'de saklayın
not: Ofloksasin, hem büyüyen hem de büyümeyen bakteri hücreleri için yaygın olarak kullanılan bir kinolon antibiyotiktir14,21. E. coli MG1655 hücreleri için OFX'in minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) 0.039-0.078 μg/mL aralığındadır. Ayrıca, ampisilin ve kanamisin gibi diğer antibiyotiklerin kalıcı araştırmalarda yaygın olarak kullanıldığını unutmayın. Antibiyotik seçimi, çalışmanın doğasına bağlıdır.
- E. coli MG1655 hücre stokları: 14 mL'lik bir test tüpünde (geçmeli kapaklı) tek bir koloni ile 2 mL normal LB ortamını aşılayın ve hücreleri 250 rpm ve 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıda kültürleyin. Hücreler durağan faza ulaştığında, 500 μL hücre kültürünü 500 μL %50 gliserol (steril) ile kriyojenik bir şişede karıştırın ve -80 °C'de saklayın.
2. Önceden var olan kalıcıları ortadan kaldırmak için hücrelerin yayılması
- Bir gece boyunca bir kültür hazırlamak için, steril bir pipet ucu ile donmuş bir hücre stoğundan az miktarda hücreyi kazıyın (gliserol hücre stoğunu çözmeyin) ve hücreleri 14 mL'lik geçmeli kapaklı bir test tüpünde 2 mL modifiye LB ortamında aşılayın. Hücreleri 12 saat boyunca 250 rpm ve 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıda kültürleyin.
- İlk yayılma
- 12 saat sonra, steril alüminyum folyo ile kaplanmış 250 mL'lik şaşkın bir şişede 250 μL gece boyunca kültürü 25 mL taze modifiye LB ortamına aktarın.
- Hücre kültürünü, hücreler orta üstel faza ulaşana kadar (OD600 = 0.5) 250 rpm ve 37 °C'de bir orbital çalkalayıcıda büyütün.
- Her 30 dakikada bir mikroplaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu 600 nm'de (OD600) ölçün.
- İkinci yayılma
- OD600 = 0.5'te, ilk şişeden 250 μL hücre kültürünü 250 mL'lik şaşkın bir şişede 25 mL taze modifiye LB ortamına seyreltin.
- İkinci hücre kültürünü bir orbital çalkalayıcıda 250 rpm ve 37 °C'de OD600=0.5'e kadar büyütün.
- Optik yoğunluğu her 30 dakikada bir
ölçün
not: Bir gece kültürü, önemli miktarda kalıcı hücreye sahip olabilir. Yukarıda açıklanan seyreltme/büyüme döngüsü yöntemi, hücreleri mikrodizilere aktarmadan önce önceden var olan bu kalıcıları ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Bunların eliminasyonu, Protokol 3'te açıklanan tahlil ile gece boyunca kültürlerin kalıcı seviyelerinin ölçülmesiyle doğrulanabilir.
3. Önceden var olan kalıcı hücrelerin ortadan kaldırılmasının doğrulanması
- İkinci yayılmadan sonra (bkz. adım 2.3), 250 μL hücre kültürünü (OD600 = 0.5) 250 mL karıştırılmış bir şişede 25 mL taze modifiye LB ortamında seyreltin.
not: Kontroller için, 250 μL gece kültürünü (bkz. adım 2.1) 250 mL şaşkın bir şişede 25 mL taze modifiye LB ortamında seyreltin. Hücreleri şişeye aktarmadan önce, gece boyunca kültürün hücre yoğunluğu, OD600 = 0.5 elde etmek için taze modifiye edilmiş bir LB ortamında ayarlanmalıdır.
- Hücre süspansiyonuna 25 μL OFX stok çözeltisi (5 mg/mL) ekleyin ve tahlil kültürünü homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe sallayın. Tahlil kültüründe OFX'in nihai konsantrasyonu 5 μg/mL'dir.
- Tahlil kültürünü 250 rpm ve 37 °C'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
- Tedavi sırasında her saatte bir (0 saat dahil, test kültürüne OFX eklenmeden önceki zaman noktası dahil), 1 mL test kültürünü şişeden 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Tahlil kültürünü mikrosantrifüj tüpünde 17.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
- Hücre peletini bozmadan 950 μL süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Mikrosantrifüj tüpüne 950 μL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ekleyin.
- Antibiyotik konsantrasyonu minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) altına düşene kadar yıkama adımları 3.5-3.7'yi toplamda 3x boyunca tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, hücre peletini 100 μL PBS çözeltisi içinde yeniden süspanse ederek 10x konsantre bir numune elde edin.
- Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 96 oyuklu yuvarlak bir alt plaka kullanarak 90 μL PBS çözeltisinde altı kez seri olarak seyreltin.
- Antibiyotik içermeyen taze agar plakaları üzerinde 10 μL seyreltilmiş hücre süspansiyonlarını tespit edin. Tespit sınırını artırmak için, kalan 90 μL hücre süspansiyonunu yeni bir agar plakası üzerine yerleştirin.
- Agar plakalarını 37 °C'de 16 saat inkübe edin ve ardından koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın. 1 mL tahlil kültüründeki toplam CFU sayısını hesaplarken seyreltme oranlarını hesaba katın. Öldürme eğrileri, antibiyotik tedavisinin süresine göre logaritmik CFU değerlerinin çizilmesiyle oluşturulur.
not: E. coli hücreleri için bifazik bir öldürme eğrisi elde etmek için 6 saatlik bir OFX tedavisi yeterlidir. Yayılan hücrelerin kalıcı seviyesi (6 saatteki CFU sayımları ile ölçüldüğü gibi), gece boyunca kültürünkinden önemli ölçüde daha düşük olmalıdır. Protokol 2 ve 3'te açıklanan prosedürler, araştırma tasarımına bağlı olarak düzenli LB ile gerçekleştirilebilir.
4. Mikrodizi plaka taramaları
- Mikrodizi-hücre kültürlerinin hazırlanması
- 250 μL üstel fazlı hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 25 mL taze modifiye LB ortamına aktarın. Homojen hale getirmek için hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın.
not: Üstel faz hücreleri (OD600 = 0.5) ikinci yayılma adımından elde edilir (bkz. adım 2.3).
- Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu 50 mL'lik steril bir rezervuara aktarın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, 150 μL hücre süspansiyonunu bir mikrodizinin her bir oyuğuna, yani çeşitli ozmolitler içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
not: Osmolit içermeyen kuyular kontrol görevi görür.
- Mikrodiziyi gaz geçirgen bir sızdırmazlık membranı ile örtün.
- Plakayı 24 h.
için 37 °C ve 250 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin
not: Bu deneylerde, çok çeşitli ozmolitler, pH tamponları ve çeşitli konsantrasyonlarda kurutulmuş halde diğer kimyasalları içeren Fenotip Mikrodizileri (PM-9 ve PM-10) gibi ticari olarak temin edilebilen plakalar kullanıldı. Bu mikrodiziler yarı alanlı 96 kuyulu plaka formatındadır. Kültür hacimleri, kullanılan plakaların tipine bağlı olarak ayarlanmalıdır. Mikrodiziler manuel olarak da oluşturulabilir.
- Mikrodizi plakaların manuel olarak hazırlanması
- 75 μL 2x ozmolit çözeltisini yarım alanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın.
- 500 μL üstel fazlı hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 25 mL 2x modifiye LB ortamına aktarın. Homojen hale getirmek için hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın.
not: Aşılama oranı, 4.1'de açıklanan mikrodizi tarama protokolü ile tutarlı olacak şekilde ayarlandı.
- 2x ozmolit çözeltisi içeren yarım alanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 75 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Plakayı 24 saat boyunca 37 ° C ve 250 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
- Kalıcı tahlil plaklarının hazırlanması
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 5 μg/mL OFX içeren 25 mL modifiye LB ortamı hazırlayın ve bu ortamı steril bir rezervuara aktarın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak rezervuardan OFX ile 190 μL modifiye LB ortamını genel bir düz tabanlı 96 oyuklu plakanın (kalıcı tahlil plakası) her bir oyuğuna aktarın.
- Mikrodiziyi çalkalayıcıdan çıkarın (24 saat kültürledikten sonra) ve mikrodiziden 10 μL hücre kültürünü OFX ile modifiye edilmiş LB ortamı içeren kalıcı-tahlil plakasının kuyularına aktarın.
- Kalıcı tahlil plakasından 10 μL hücre süspansiyonu alın ve yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plaka ve çok kanallı bir pipet kullanarak 290 μL PBS çözeltisinde üç kez seri olarak seyreltin.
- Seri seyreltmeyi takiben, çok kanallı bir pipet kullanarak antibiyotik içermeyen taze agar plakaları üzerinde seri olarak seyreltilmiş tüm hücre süspansiyonlarının 10 μL'sini tespit edin.
- Kalıcı tahlil plakasını (adım 4.3.3'te hazırlanan) plakayı gaz geçirgen bir sızdırmazlık membranı ile kapladıktan sonra 37 ° C ve 250 rpm'de 6 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
- Bir çalkalayıcıda 6 saat inkübe ettikten sonra, kalıcı tahlil plakasını çıkarın ve 4.3.4-4.3.5 adımlarını tekrarlayın.
- Agar plakalarını 37 °C'de 16 saat inkübe edin ve ardından CFU'ları sayın. Antibiyotik tedavisinden önceki ve 6 saat sonraki CFU seviyeleri, her bir oyuktaki persister fraksiyonun hesaplanmasını sağlar. OFX tedavisinden önceki CFU sayımları ayrıca ozmolitlerin ve E. coli canlılığı üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine yardımcı olur.