1. Poliglutamin eksprese eden hayvanlar kullanılarak kas dokusundaki proteostazdaki düşüşün ölçülmesi
NOT: Kas hücrelerinde proteostaz düşüşünü tanımlamak için iki yöntem kullanılabilir: yaşlanma sırasında protein agregatlarının oluşumunu görüntüleme (1.1) ve bu agregatların felç başlangıcına kadar yaşla birlikte neden olduğu proteotoksisitenin ölçülmesi (1.2).
- Yaşlanma sırasında kasta poliglutamin agrega oluşumunun görüntülenmesi
not: Kas hücrelerinde protein agregasyonunun yaşa bağlı ilerlemesi, sarı bir floresan proteine (YFP) kaynaşmış poliglutamin (polyQ) tekrarları kullanılarak görüntülenir. Bu protokol, AM140 rmIs132 [unc-54p::Q35::YFP] suşunun kullanımını ana hatlarıyla belirtir, ancak diğer poliglutamin varyant suşları da kullanılabilir. PolyQ::YFP transgeni, unc-54 kas spesifik promotör kullanılarak kasta eksprese edilir. Senkronize unc-54p::p olyQ::YFP eksprese eden hayvanlar, yetişkinliğin 1, 2, 3 ve 4. günlerinde görselleştirilir. unc-54p::p olyQ::YFP agregalarını görselleştirmek için, floresan için donatılmış bir bileşik mikroskop veya bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. AM140, Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) şu adresten temin edilebilir: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- Görüntüleme günlerinde (yetişkinliğin 1, 2, 3 ve 4. günleri), 20 hayvan seçin ve bunları %3'lük bir agaroz pedi ve 5 μL'lik bir damla 10 mM sodyum azit (M9 tamponunda seyreltilmiş) içeren bir mikroskop lam kurulumuna monte edin.
- Tüm hayvanlar sodyum azid ile hareketsiz hale getirildikten sonra (~ 5 dakika), 10x büyütme lensi kullanarak hayvanların tüm vücutlarını görüntüleyin (Şekil 1A). Görüntüleme için bir FITC filtresi ve her hayvan için aynı pozlamayı kullanın. Görüntülemeden sonra slaytları atın.
not: Alternatif olarak, YFP odakları doğrudan plakalar üzerinde de ölçülebilir, ancak puanlama sırasında plaka üzerine bir karbondioksit akışı uygulanarak hareket engellenmelidir. Bu alternatif yöntem, çok sayıda koşulu tararken en uygun yöntemdir.
- Görüntülerin alınmasından sonra, tüm hayvanın vücut duvarı kaslarındaki odak sayısını sayın. Odaklar, arka plandaki daha kısık çözünür sinyalden ayırt edilebilen daha parlak noktalanmış sinyallerdir.
- 1, 2, 3 ve 4. günlerden itibaren YFP odak birikiminin ilerlemesini çizin. X'in yetişkinlik günlerini temsil ettiği ve Y'nin unc-54p::p olyQ::YFP odaklarının sayısını temsil ettiği bir XY grafiği çizin (Şekil 1B). Deney koşulundaki odakların sayısı (örneğin, gen aşağı regülasyonu veya aşırı ekspresyon) kontrol hayvanlarıyla karşılaştırılır. Her deneme için gözlemlenen her zaman noktasında gruplar arasında istatistiksel analiz yapın.
- Yalnızca iki koşul için odak sayımlarını karşılaştırırken, her zaman noktasında bağımsız bir örnek t-testi gerçekleştirin.
- İkiden fazla koşul için odak sayımlarını karşılaştırırken, o zaman noktasındaki tüm koşullara ilişkin veriler de dahil olmak üzere her zaman noktası için çok yönlü tek yönlü bir ANOVA analizi gerçekleştirin. Omnibus ANOVA anlamlı bir p değeri verirse (yani, p < 0.005), odaklarda önemli bir farkın tespit edildiği spesifik koşulları belirlemek için ikili bağımsız örneklem t-testleri ile bir post-hoc analiz yapın (örneğin, A, B ve C grupları için A & B, A & C ve B & C'yi karşılaştırın).
2. Kas hücrelerinde poliglutamin toksisitesinin vekili olarak hayvan felç oranlarının ölçülmesi
>NOT: Kaslardaki polyQ agregatlarının yaşa bağlı artışı, hareketi sağlayan kas fonksiyonunun azalmasına neden olur. Hareketteki bu kusur, poliQ eksprese eden hayvanlarda ilerleyici felç oranının ölçülmesiyle belirlenebilir. Felç testi için, senkronize unc-54p::p olyQ::YFP eksprese eden hayvanlar yetişkinliğin 3, 5, 7 ve 9. günlerinde puanlanır. Genetik bozulmanın etkisinin değerlendirilebilmesi için puanlama aralığını genişletmek için gerektiği kadar ek zaman noktaları ekleyin.
- Puanlama günlerinde (yetişkinliğin 3, 5, 7 ve 9. günleri), 50 hayvan içeren 6 cm'lik plakalara bakın ve felçli hayvanların sayısını kaydedin. Felçli hayvanları plakadan çıkarın. Hayvanlar plakadan sürünerek çıkmışsa veya ölmüşse, sansürlenmelidir; Analizde hesaba katılabilmesi için olayı kaydedin.
not: Bir hayvan, hafif veya hafif dokunma uyaranlarına maruz bırakıldıktan sonra herhangi bir hareket gözlenmediğinde felçli olarak kabul edilir. Faringeal pompalama aktivitesi, hareket etmeyen hayvanların canlı mı yoksa ölü mü olduğunu belirlemek için kullanılır.
- Deneyin tamamlanmasının ardından, her koşul için felç oranını hesaplayın. Bunu, her bir zaman noktasında, felçli hayvanların fraksiyonunu, o durum için gözlemlenen toplam hayvan sayısına bölerek yapın. Zaman noktası başına koşul başına birden fazla plaka gözlemliyorsanız (yani, plakaları çoğaltıyorsanız), oranı her bir kopya için ayrı ayrı hesaplayın.
- Felç oranının ilerlemesini bir XY grafiğinde (dağılım grafiği) çizin. X yetişkinlik günlerini, Y ise felç oranlarını temsil eder. unc-54p::p olyQ::YFP hayvanlarının felç oranı kontrol hayvanları ile karşılaştırılmıştır (Şekil 1C). Gruplar arasında istatistiksel analiz yapın; Birden fazla deneme için, denemeleri bağımsız olarak tedavi edin. Cox Orantılı Tehlikeler Regresyonunu ve Wald testini kullanın. Hayatta kalma analizini destekleyen çoğu veri analizi aracı, Cox modellemesini de destekler.
- Verileri dönüştürün: Her koşulun, biri zaman ve diğeri "olay" için olmak üzere iki sütunu olmalıdır. Gözlemlenen her zaman noktasında, felçli her hayvan için "0" ve sansürlenmiş her hayvan için "1" olan bir satır ekleyin. Toplam sıra sayısı, bu durum için plakadaki başlangıç hayvanlarının sayısına eşit olmalıdır.
- İstatistik yazılımının talimatlarına göre Cox Oransal Tehlikeler modellemesini ve ardından Wald testini gerçekleştirin. Tipik deney tasarımları için tek değişkenli bir model uygun olacaktır. İkiden fazla koşul için, tüm koşulların dahil edildiği bir test anlamlı bir sonuç gösteriyorsa (yani, p < 0.005), belirli anlamlı koşul çiftlerini belirlemek için koşullar arasında ikili testler yapılabilir.
not: Cox modeli, test koşul(lar)ının bir olayın olasılığını zaman içinde orantılı olarak modüle ettiği varsayımına dayanır. Bu, örneğin, Cox modelinin, çoğu hayvanın 1. günde felç olduğu bir durumu, çoğu hayvanın 9. günde felç olduğu bir durumla karşılaştırmak için uygun olmayacağı anlamına gelir. Cox modelinin uzantıları ve her bir zaman noktasında felç olmuş oranları karşılaştırmak için diğer yaklaşımlar, orantılı tehlike varsayımının geçerli olmadığı durumlar için mevcuttur.
