Bakteriyel Ko-İnkübasyon Testi: Tek Hücre Düzeyinde Spesifik Dışı Bakteriyel Rekabeti Görselleştirmek için Floresan Mikroskobu Tabanlı Bir Teknik

Özet

Kaynak: Smith, S., et al., Tek Hücreli Floresan Görüntüleme Kullanılarak Bakteriler Arası Rekabetin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, tek hücre düzeyinde bakteri rekabetini incelemek için floresan mikroskobu tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, bakteri topluluklarının yapısı ve işlevi hakkında bilgi sağlar.

Protokol

1. Bakteri suşlarını küp haline getirin

1. Tek hücreli bakteri rekabet deneyleri için iki bakteri suşu seçin. Burada, V. fischeri'nin iki suşu kullanılır: bir hedef suş (ES11424) ve bir inhibitör suşu (MJ1125), kromozom II (T6SS2)1 üzerindeki tip VI salgı sistemini kullanarak hedef suşu öldürdüğü bilinmektedir, bu da temasa bağlı bir öldürme mekanizmasıdır.
2. Mikroskopta gerinim tiplerini görsel olarak ayırt etmek için farklı floresan proteinler (örneğin, GFP veya RFP) için genleri kodlayan kararlı plazmitlerle suşları dönüştürün. Burada, inhibitör suşu, GFP kodlayan bir plazmit (pVSV102) ile etiketlenir ve hedef suş, dsRed kodlayan bir plazmit (pVSV208) ile etiketlenir.
3. Her iki suş için orta log kültürlerle başlayın, tüm numuneler için optik yoğunluğu 600 nm'de (OD₆₀₀) ölçün ve kaydedin.
4. Kültürü LBS ortamı ile seyrelterek her numuneyi V. fischeri için yaklaşık 10⁹ CFU/mL'ye karşılık gelen bir OD₆₀₀ = 1.0'a normalleştirin.
5. Etiketli 1.5 mL'lik bir tüpe her normalleştirilmiş suştan 30 μL ekleyerek iki rakip suşu hacme bağlı olarak 1: 1 oranında karıştırın. Karışık gerinim kültürünü 1-2 s.
   için vorteksleyin not: Bazı durumlarda kokültürlerin farklı oranlarda karıştırılması uygun olabilir. Örneğin, bir suş diğerinden çok daha hızlı büyüdüğünde, rekabeti gözlemlemek için daha yavaş büyüyen suşa sayısal bir avantajla başlamak gerekebilir. OD₆₀₀, her iki suş için benzer CFU / mL'ye karşılık gelmiyorsa optimizasyon da gerekli olabilir.
6. Her biyolojik çoğaltma ve tedavi için adım 1.5'i tekrarlayın. Burada gösterilen örnekte, bu, toplam dört karışık gerinim tüpü ile sonuçlanacaktır: hedef suşla karıştırılmış vahşi tip inhibitör suşuna sahip iki biyolojik kopya ve hedef suşla karıştırılmış tip VI salgı sistemi mutant suşuna sahip iki biyolojik kopya.
7. Rakip hücrelerin, agar pedi üzerindeki kuşe kübasyonda temasa bağlı öldürme için yeterince yoğun olmasını sağlamak için, karışık kültürü standart bir 1.5 mL santrifüj tüpünde 21.130 x g'da 1 dakika santrifüjleyerek, süpernatanı atarak ve her peleti 20 μL lbs ortamda yeniden süspanse ederek her bir karışık kültürü 3 kat konsantre edin. Her numune için tekrarlayın.
   not: Bazı bakteri hücreleri, yüksek rcf'de santrifüjlemeden kaynaklanan hasara karşı hassastır; Bu gibi durumlarda, karışık kültür 4600 x g'de 3 dakika boyunca santrifüjlenebilir. Ek olarak, temasa bağlı rekabeti ölçerken, öldürmeyi gözlemlemek için slayt üzerinde yeterli hücre yoğunluğunu sağlamak önemlidir. Bu makalede, öldürmenin gözlendiği "kalabalık" tedavilerde yaklaşık 10 hücre/20^μm2 vardı.

2. Slayt kurulumu

1. Dik bir mikroskop kullanırken, standart 1 mm'lik bir cam slayt üzerine ~5 mm'lik 2 agarozlu bir ped yerleştirin. Agaroz pedinin üzerine 2 μL karışık kültür yerleştirin ve noktanın üzerine # 1.5 lamel (25 mm²) yerleştirin. Şekil 1B'ye bakın.
2. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanırken, 35 mm'lik bir Petri kabının #1.5 lamel tabanına 2 μL karışık kültür yerleştirin ve madeni para yuvası noktasının üzerine ~ 5 mm² agaroz pedi yerleştirin. Agaroz pedin üzerine 12 mm'lik dairesel bir cam lamel yerleştirin. Bir örnek için Şekil 1C'ye bakın.
3. Kalan üç karışık kültür için kullanılan mikroskop kurulumuna bağlı olarak 2.1 veya 2.2 adımlarını tekrarlayın, böylece dört slayt veya tabak görüntülenecektir.
4. Devam etmeden önce slaytların yaklaşık 5 dakika tezgah üzerinde oturmasına izin verin. Bu, hücrelerin agar pedine yerleşmesini ve görüntüleme işlemi sırasında hareketi ortadan kaldırmasını sağlar.

3. Floresan mikroskobu

1. Foto ağartmanın etkilerini en aza indirmek için beyaz ışık (faz kontrastı veya DIC) kullanarak hücrelere odaklanarak başlayın. Tek bir bakteri hücresinin ortalama boyutuna bağlı olarak, 60x veya 100x yağ hedefi kullanın.
2. Her kanal için pozlama süresini ve çekim ayarlarını, hücreler minimum arka plan algılamasıyla uygun kanalda görünecek şekilde ayarlayın.
   not: Farklı kanallar için farklı maruz kalma süreleri kullanmak uygundur, ancak belirli bir kanal için tüm biyolojik kopyalar ve tedaviler için aynı maruz kalma süresi kullanılmalıdır.
3. Her örnek için en az beş görüş alanı (FOV) seçin ve alma ayarlarını kullanarak her uygun kanalda görüntü alın (Şekil 2'deki örneklere bakın). Her FOV'dan XY noktalarını kaydedin, böylece aynı FOV son zaman noktasında görüntülenebilir. Analiz adımları sırasında hedef veya inhibitör hücrelerin kapladığı alanın oranını belirlemek için her zaman noktasında aynı FOV'un görüntülenmesi gereklidir.
   not: Bu örnekte, GFP'nin floresansı, 467 - 498 nm uyarma dalga boyuna sahip bir filtre ve 513 - 556 nm'lik bir emisyon filtresi kullanılarak tespit edilir ve sahte yeşil renklidir. dsRed'in Floresansı, 542 - 582 nm uyarma dalga boyuna ve 603 - 678 nm emisyon filtresine sahip bir filtre kullanılarak tespit edilir ve yanlış renkli macentadır.
4. 2 saat sonra, önceden kaydedilmiş XY noktalarını kullanarak her numune için yukarıdaki adımı tekrarlayın (Şekil 2).
   not: Sonraki görüntülerin zamanlamasının, farklı büyüme oranlarına veya rekabetçi mekanizmalara sahip organizmalar için optimize edilmesi gerekebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Madeni para deneyleri için agaroz ped hazırlama ve slayt kurulumu. (A) %2 agaroz pedleri yapmak için kurulum. Beş kat laboratuvar bandı (yeşil), yaklaşık 20 mm aralıklarla iki noktada bir lamele etrafına sarılır. Daha sonra, deniz Fosfat Tamponlu Salin (sarı) içindeki ılık% 2 agaroz, bant parçaları arasına pipetlenir ve hemen 25^mm2'lik bir kapak kayma ile kaplanır ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL Mikrosantrifüj tüpü	balıkçı	05-408-129
10 uL tek kanallı pipet
1000 uL tek kanallı pipet
20 uL tek kanallı pipet
200 uL tek kanallı pipet
agaroz	balıkçı	BP165-25	Düşük erime noktalı agaroz
Cellvis 35 mm Çanak	balıkçı	NC0409658	#1.5 Cam Alt Kapak
Kloramfenikol	Sigma	C0378	stok (etanol içinde 20 mg / mL); ortamdaki son konsantrasyon (2 μg / mL LBS)
FIJI görüntü analizi yazılımı	ResimJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Açık kaynaklı yazılım
Fisherbrand Kapak Camları: Daireler	balıkçı	12-545-81P	# 1.5 kapak camı; 12 mm çap
Kanamisin Sülfat	balıkçı	BP906-5	stok (100 mg / mL suda, filtre sterilize); ortamdaki son konsantrasyon (1 μg / mL LBS)
Lens Temizleme Mendil Kağıdı	balıkçı	S24530 Serisi
Petri Plakaları	balıkçı	FB0875713	kapaklı steril
Tıraş Bıçakları	balıkçı	S65921 Serisi
Yarı Mikro Küvetler	VWR (VWR)	97000-586
Spektrofotometre
Thermo Scientific Altın Mühür Düz Mikroskop Slaytları	balıkçı	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Kapak Camı	balıkçı	22-050-235	#1,5 kapak camı, 25 mm2
F Tipi Daldırma Yağı	balıkçı	NC0297589
Kamera ve görüntüleme yazılımı ile dik veya ters floresan mikroskobu			Bu makaledeki görüntüler, NIS-Elements yazılımı kullanılarak bir ORCA-Fusion Dijital CMOS kamera ile donatılmış bir Nikon TI-2 ters floresan mikroskopta elde edilmiştir.
girdap
Su banyosu			Pipetlemeden önce agarozu sıcak tutmak için kullanılır
LBS ortamı
1M Tris Tamponu (pH ~ 7.5)			50 mL 1 M stok tamponu (62 mL HCl, 938 mL DI su, 121 g Trizma Baz)
Ağar Teknik	balıkçı	DF0812-17-9	15 g (Sadece tabaklar için ekleyin)
DI su			950 mL
Sodyum Klorür	balıkçı	S640-3 Serisi	20 gr
Tripton	balıkçı	BP97265	10 gr
Maya Özü	balıkçı	BP9727-2	5 gr
mPBS (deniz PBS'si)			Deniz tuzları eklenmiş fosfat tamponlu salin; agaroz ped yapmak için kullanılır
10 kat PBS	balıkçı	ICN1960454
Anında Okyanus Deniz Tuzu	Anında Okyanus	SS1-160P	Konsantrasyonu uygun tuzluluğa ayarlayın; burada 20 psu kullanılır
Steril Vakum Filtre Üniteleri	balıkçı	SCGVU01RE	mPBS'yi filtreyle sterilize etmek için kullanılır
Vakum pompası			mPBS'yi filtreyle sterilize etmek için kullanılır