Amplifiye Lüminesan Yakınlık Homojen Deneyi: Protein-Protein Etkileşimlerini İnhibe Eden Küçük Molekülleri Taramak için Boncuk Tabanlı Bir Yakınlık Testi

Özet

Kaynak: Wang, L. et al., Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Şaperon-Koşaperon Etkileşimleri Üzerine Çalışmalar. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, boncuk tabanlı bir yakınlık testi olan güçlendirilmiş ışıldayan yakınlık homojen testini gösteriyoruz. Protein etkileşimlerini inhibe eden potansiyel küçük molekülleri taramak için etkileşime girme eğiliminde olan iki protein ile hareketsiz hale getirilmiş, homojen boyutta alıcı ve verici boncuklar kullanır.

Protokol

NOT: Bu protokolün genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'nin ekspresyonu ve saflaştırılması (Şekil 1A)

1. Plazmitler
   NOT: IMAGE konsorsiyumundan insan FKBP51 (klon kimliği: 5723416) ve insan FKBP52 (klon kimliği: 7474554) için cDNA klonları edinin.
   1. İnsan FKBP51 DNA'sını, BamHI ve XhoI çıkıntıları içeren primerlerle (ileri; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', geri; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') PCR ile amplifiye edin ve BamHI / XhoI kısıtlama bölgelerinde pGEX6-1 vektörüne klonlayın.
   2. İnsan FKBP52 DNA'sını, EcoRI ve XhoI çıkıntıları içeren primerlerle (ileri; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', geri; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') PCR ile amplifiye edin ve EcoRI / XhoI kısıtlama bölgelerinde pGEX6-2 vektörüne klonlayın.
      not: PCR reaksiyon kurulumu ve koşulları Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmiştir.
   3. Eklenen diziyi doğrulayın ve plazmitleri üretim protokolüne göre kimyasal olarak yetkin E. coli'ye dönüştürün.
2. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması
   1. LB çözeltisini yapmak için 1 L damıtılmış suya 25 g Luria suyu (LB) bazı ekleyin. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayın. Soğuduktan sonra 50 μg/mL ampisilin ekleyin.
   2. GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 eksprese eden bir bakteri kolonisi alın ve 1.5 mL'lik bir tüpte 500 μL LB çözeltisi ile karıştırın. Girdap.
   3. "1.2.2" karışımını, alüminyum folyo ile kaplanmış Erlenmeyer şişesinde 1 L LB çözeltisine ekleyin. Erlenmeyer şişesini gece boyunca 37 °C'de çalkalayıcıda inkübe edin.
   4. Erlenmeyer şişesine 1 mM izopropil-β-D-tiyogalaktozit (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin ve inkübasyona 2 saat daha devam edin.
   5. Hücre peletlerini elde etmek için, 15 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın.
      not: Hücre peletleri -20 °C'de saklanabilir.
   6. Hücre peletlerini 40 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 3 x 20 sonikasyon yapın. Proteolizi önlemek için 1 mM PMSF, 1 mM EDTA ve proteaz inhibitör kokteyli (1 tablet) ekleyin.
   7. Hücre kalıntılarını gidermek için süspansiyonu 30 dakika 50.000 x g santrifüjleyin ve süpernatanı 5 mL GST tuzağı kolonuna uygulayın.
   8. Kolonu 30 mL PBS ile yıkadıktan sonra, GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'yi PBS'de 5 mL 10 mM glutatyon ile elüte edin.
   9. Proteinleri 15 mL 10.000 MWCO santrifüj ünitesinde konsantre edin. Serbest glutatyonu çıkarmak için, konsantreleri 0,5x PBS ile dengelenmiş PD-10 kolonundan geçirin ve tekrar filtre santrifüj cihazına konsantre olun.
   10. Protein içeren fraksiyonları toplayın. SDS-PAGE'deki proteinleri doğrulayın ve protein konsantrasyonlarını 1 mg / mL'ye ayarlayın.
       not: Tipik protein verimi 2-5 mg/L kültürdür. Protein -20 °C'de saklanabilir.

2. Hsp90 C-terminal peptidinin alıcı boncuklara bağlanması (Şekil 1B)

1. Hsp90 peptit hazırlama
   1. Bir peptit sentez servisi ile insan Hsp90 beta izoformunun (UniProt ID: P08238) 714-724 amino asitlerine karşılık gelen on amino asit peptit NH 2-EDASRMEEVD-COOH'yi sentezleyin.
   2. Hsp90 peptidini PBS'de 1 mg / mL konsantrasyona seyreltin.
2. Alıcı boncukların hazırlanması
   1. Konjuge olmayan alıcı boncukları PBS'de 1 mg / mL konsantrasyona seyreltin ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. Yıkamayı 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile gerçekleştirin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
3. konjugasyon
   1. Boncuklar ve peptit arasındaki oranı 10:1 olarak ayarlayın. 1 mg alıcı boncuk peleti içeren 1.5 mL'lik tüpe (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış), 1 mL PBS (pH 7.4), 0.1 mg seyreltilmiş peptit, 1.25 μL Tween-20, 10 μL 400 mM'lik bir sodyum siyanoborohidrit çözeltisi (NaBH₃CN) suya ekleyin.
      Dikkat: NaBH₃CN toksiktir; Çeker ocak ve eldiven kullanın. NaBH₃CN çözeltisi taze olarak hazırlanmalıdır.
   2. Döner bir çalkalayıcı üzerinde uçtan uca çalkalama (10-20 rpm) ile 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
4. Reaksiyon söndürme ve boncuk yıkama
   1. Reaksiyona girmemiş bölgeleri bloke etmek için reaksiyona 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   2. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'da (veya maksimum hızda) santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve boncuk peletini 1 mL Tris-HCl çözeltisi (100 mM, pH 8.0) içinde yeniden süspanse edin.
   3. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
   4. Son santrifüjlemeden sonra, boncukları depolama tamponunda 1 mg / mL'de yeniden süspanse edin (koruyucu olarak% 0.01 sodyum azid ile 1 mL 0.5 × PBS). Konjuge alıcı boncuk çözeltisini 4 °C'de ışık korumalı olarak saklayın.
      Dikkat: Sodyum azit toksiktir; Çeker ocak ve eldiven kullanın.

3. GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ve Hsp90 C-terminal peptidi arasındaki etkileşimi ve küçük moleküler kütleli bileşiklerle inhibisyonun araştırılması (Şekil 1C)

1. Glutatyon donör boncukları ile etkileşime giren GST etiketli proteinler
   1. Reaksiyonları 384 oyuklu plakalarda ayarlayın.
   2. 10 μg/mL glutatyon donör boncuk içeren çözeltiyi 0.5x PBS, pH 7.4.
      not: Uzun süreli depolamadan sonra boncuklar yerleşir ve girdaplanması gerekir.
   3. GST-FKBP51 veya GST-FKBP52'yi 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
   4. Karanlıkta 25 °C'de 10 dk.
      inkübe edin not: Bu adımda, GST etiketli proteinler, boncuklara bağlı glutatyon ile etkileşime girecektir. Her kuyucuk için bu karışımın 22,5 μL'si kullanılacaktır. Bağlayıcı ortakların konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir. GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'yi titre edin ve en iyi sinyali veren konsantrasyonu seçin.
2. Bileşik ekleme
   1. DMSO.
      'da test bileşiklerinin seri seyreltmelerini yapın not: Kullanılan konsantrasyonlar tipik olarak 10, 30, 100, 300, 1.000 ve 3.000 μM'dir.
   2. Plakanın her bir oyuğunun köşesine 0.25 μL DMSO (negatif kontrol) veya Hsp90 C-terminal peptid (pozitif kontrol, 30 μM) veya DMSO'daki bileşikler ekleyin. Her bileşik konsantrasyonu için üçlü kopyalar kullanın.
   3. Her oyuğa GST etiketli proteinler içeren glutatyon donör boncukları içeren çözeltiden 22.5 μL ekleyin.
   4. Plakayı elinizle nazikçe, ancak iyice sallayın. Karanlıkta 25 °C'de 15 dk.
      inkübe edin not: Bu süre zarfında, bileşikler Hsp90 C-terminal peptit bağlanma bölgesindeki TPR alanı ile etkileşime girecektir.
3. Alıcı boncuk ilavesi
   1. Alıcı boncukları ekli Hsp90 C-terminal peptidi ile 0.5x PBS'de 100 μg / mL'ye seyreltin.
   2. Her oyuka 2.25 μL seyreltilmiş alıcı boncuk ekleyin.
   3. Yavaşça ama iyice karıştırın. Karanlıkta 25 °C'de 15 dk.
      inkübe edin not: Bu adımda, donör ve alıcı boncuklar, protein-peptit etkileşimleri ile yakınlaştırılır. Reaksiyon karışımının son hacmi 25 μL'dir. Bu nedenle, bileşiklerin nihai konsantrasyonları 0.1 ila 30 μM arasında değişmektedir.
4. Plaka okuma
   not: İlgili modda ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
   1. Enstrümanı açın ve yazılımı açın
   2. İlgili protokolü seçin.
   3. Plaka haritasını düzenle'ye tıklayın ve ölçüm için plakada kullanılan kuyuyu seçin.
   4. Devam etmek için İleri'ye tıklayın ve seçili protokolü çalıştırın.
   5. Ölçümden sonra, sonuçları görüntülemek için Sonuçları Göster'e tıklayın.
   6. Verileri dışa aktarın.

Tablo 1: İnsan FKBP51 ve FKBP52 DNA amplifikasyonu için PCR reaksiyonu kurulumu.

Reaksiyon bileşeni	Hacim (μL)
PCR tamponu (5 x konsantre)	4
İleri astar	1
Ters astar	1
Plasmid	0,5
dNTP karışımı (her biri 10 mM)	0,5
Phusion DNA polimeraz	0,5
Su (DNA derecesi)	12,5
toplam	20

Tablo 2: İnsan FKBP51 ve FKBP52 DNA amplifikasyonu için termosiller koşulları.

safha	Sıcaklık (°C)	Saat	Döngü
İlk denatürasyon	94	3 dk	1
denatürasyon	94	30 saniye
Tavlama	56	30 saniye
uzantı	72	1 dk
Son uzatma	72	5 dk	1
Not: Kapak sıcaklığı 105 °C'dir.

Sonuçlar

Şekil 1: Bu protokolün şeması. (A) GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'nin ekspresyonu ve saflaştırılması. (B) Hsp90 C-terminal peptidinin alıcı boncuklara bağlanması. (C) GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ve Hsp90 C-terminal peptidi arasındaki etkileşimi araştıran tahlil. Küçük moleküler kütleli bileşiklerle inhibisyon.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
384 oyuklu plakalar	Perkin Elmer	6008350	Tahlil hacmi 25 ml
Amicon 10.000 MWCO santrifüj ünitesi	Kırlangıç	UFC901008	Konsantre protein
Ampisilin	Sigma	A0166	Antibiyotik
Bakteri çalkalayıcı Unimax 1010	Heidolph		Kültür bakterileri
İnsan FKBP51 için cDNA klonları	Kaynak: BioScience	Klon Kimliği: 5723416	pCMV-SPORT6 vektörü
İnsan FKBP52 için cDNA klonları	Kaynak: BioScience	Klon Kimliği: 7474554	pCMV-SPORT6 vektörü
Kimyasal Olarak Yetkin E. coli	Canlandırıcı	C602003	Tek Çekim BL21 Yıldızı (DE3)
DMSO (Türkçe)	Supelco Teknolojisi	1.02952.1000	Seyreltik bileşikler
DPBS (DPBS)	Gibco (Gibco)	14190-144	Çözelti hazırla
Edta	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	344504	Sonikasyon sırasında proteolizi önleyin
Glutatyon	Sigma	G-4251	Elute GST etiketli proteinler
Glutatyon donör boncukları	Perkin Elmer	6765300	Donör boncuğu
GST tuzağı sütunu	Cytiva (GE Sağlık Hizmetleri)	17528201	GST etiketli proteinleri saflaştırın
İzopropil-β-D-tiyogalaktozit	Thermo Fisher Bilimsel	R0392	Protein ekspresyonunu indükleyin
LB Et Suyu (Değirmenci)	Sigma	L3522	Mikrobiyal büyüme ortamı
PCR cihazı	BIYO-RAD	S1000 Termal Döngüleyici	Amplifikasyon/PCR
PD-10 sütunu	Cytiva (GE Sağlık Hizmetleri)	17085101	Çözüm değişimi
pGEX-6P-1 vektörü	Cytiva (GE Sağlık Hizmetleri)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vektörü	Cytiva (GE Sağlık Hizmetleri)	28954650	Plasmid
Plaka okuyucu	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Çok Etiketli Okuyucu	Alfa plakasını oku
Plaka okuyucu yazılımı	Perkin Elmer	EnSpire Yöneticisi	Plaka okuyucu yazılımı
Plaka okuyucu yazılım protokolü	Perkin Elmer	Alfa 384 kuyusu Düşük hacim	Plakayı okumak için bu protokolü kullanın
PMSF (Başbakanlık)	Sigma	P7626	Sonikasyon sırasında proteolizi önleyin
proteaz inhibitörü kokteyli	Sigma	S8830 Serisi	Sonikasyon sırasında proteolizi önleyin
Sodyum azid	Sigma	S2002 Serisi	Koruyucu olarak
Sodyum siyanoborohidrit (NaBH3CN)	Sigma	156159	Kuplaj için matrisi etkinleştirir
İnsan Hsp90 beta izoformunun 714-724 amino asitlerine karşılık gelen on amino asit peptidi NH2-EDASRMEEVD-COOH	Peptit 2.0 inc		Hsp90 C-terminal peptidini sentezleyin
Test Tüpü Döndürücü	LABORATUVAR ÜRÜNLERİ		Uçtan uca ajitasyon yapın
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Tepkileşmemiş alıcı boncuk bölgelerini engelleyin
Ara-20	Sigma	P1379 Serisi	Boncuk toplanmasını önleyin
Ultra santrifüj Avanti J-20 XP	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.		Bakteri hücresi peletlerini elde etmek için santrifüjleyin
Ultrasonik hücre bozucu	Mikro Oğul		Proteini serbest bırakmak için hücreleri sonikat
Konjuge olmayan alıcı boncuklar	Perkin Elmer	6762003	Alıcı boncuklar
XCell SureLock Mini Hücre ve XCell II Blot Modülü	Canlandırıcı	EI0002	SDS-SAYFASI

Serisi Belediyesi ) Zırhlı Serisi Serisi Serisi Serisi