Virüs Plak Testi: Virüsle enfekte olmuş hücrelerin tek tabakasında oluşan plakların miktar tayini yoluyla enfeksiyöz herpes simpleks virüsünü ölçmek için bir teknik

Özet

Kaynak: Sadowski, L. A. et al. Herpes Simpleks Virüslerinin Yayılması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, enfeksiyöz herpes simpleks virüsü veya HSV'nin virüs plak testi açıklanmaktadır. Seyreltilmiş viral partiküller, epitel hücrelerinin tek tabakasına aşılanır. Kuluçka sırasında, virüs plaklar oluşturur ve bulaşıcı virüs titresini belirlemek için görsel olarak sayılır.

Protokol

1. Vero hücrelerinin tohumlanması

1. Plak tahlilini başlatmadan bir gün önce, Vero hücrelerini tripsinize edin ve bunları düzenli Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamında (DMEM) yeniden süspanse edin ve standart hücre kültürü metodolojisine göre takviye edin. Tripsinlenmiş hücreleri, birleşik Vero hücrelerinin (~ 10⁷ hücre) T-75 şişesi başına 10 mL DMEM içinde yeniden süspanse edin.
   NOT: DMEM, alfa-MEM yerine plak tahlilleri için kullanılır, çünkü hücre büyüme hızını biraz yavaşlatır ve daha iyi plak tahlil sonuçlarını destekler.
2. Hücreleri kişinin tercih ettiği yöntemle sayın (örneğin, Tripan Mavisi dışlamalı standart bir hemositometre).
3. Hücreleri 4 x 10⁶ hücre / plakada tohumlayın; HSV-2 için, oyuk başına 2.5 mL DMEM (takviyelerle birlikte) içeren 6 oyuklu plakalar kullanın; ve HSV-1 için, kuyucuk başına 1.25 mL DMEM (takviyelerle birlikte) içeren 12 oyuklu plakalar kullanın.
   NOT: Hücre sayısı, kullanılan plakadan bağımsız olarak sabit olmalıdır, ancak kuyucukların boyutu plak tahlilinde doğrulukla ilgili konulardır. Hücrelerin eşit bir şekilde dağılması esastır, bu da plakayı dairesel bir şekilde değil, ileri geri hareket ettirerek en etkili şekilde gerçekleştirilebilir.
4. Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca 37 °C /% 5 CO_2'de büyümesine izin verin.
   NOT: Nem, inkübatörün dibinde bir algisit içeren bir tencere damıtılmış su ile korunur.

2. Örnek seyreltme

1. Numune seyreltmesini ve virüsün hücrelere eklenmesini bir laboratuvar oturumunda tamamlayın.
   DİKKAT: HSV-1 ve -2 insanlar için bulaşıcıdır ve uygun biyogüvenlik muhafazası (BSL-2) altında ele alınmalıdır. Virüsle temas eden tüm malzemeleri ayrı tutun ve biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce 1/256 seyreltmede dörtlü bir ajan (Malzeme Tablosuna bakınız), iyodofor, ağartıcı veya güçlü iyonik deterjan (örn. SDS) ile dezenfekte edin.
2. Vero hücrelerinin tohumlanmasından bir gün sonra, 1x PBS'de plaklanacak her virüs örneğini seri olarak seyreltin; en hassas izleme için tipik olarak 10 kat seyreltme kullanın.
3. Bu seyreltmeleri ^10-4 (düşük virüs konsantrasyonları için) veya ^10-9 (daha yüksek titre numunelerinin beklentileri için) ile yapın ve plak testinin kendisi için her numuneden en az 1 mL kalan kısımda yapın.
4. Bu seyreltilmiş virüs örneklerini hücrelere eklemeye hazır olana kadar tüm viral seyreltmeleri buz üzerinde (1 saatten fazla olmamak üzere) tutun.

3. Hücrelere virüs eklenmesi

1. Hücre kültürü ortamını bir veya iki kuyucuktan bir pipetle çıkarın.
   NOT: Aspiratör kullanmayın çünkü hücre tek tabakasından çok fazla sıvıyı uzaklaştırır ve hücreleri kurutur. Önemli bir husus, hücre tek tabakasının deneyin tüm seyri boyunca nemli kalmasını sağlamaktır. Hücreler kurursa, son adımda plakayı yıkarlar ve kullanılamaz veriler üretirler. Bu nedenle, bu olasılığı azaltmak için bir seferde yalnızca bir veya iki kuyu işleyin.
2. Seyreltilmiş virüs örneğini (sırasıyla 6 oyuklu ve 12 oyuklu plakalar için 100-400 μL ve 50-200 μL virüs örneği kullanılır) her bir tek katmana damla damla dikkatlice ekleyin ve damlaları her bir oyuğun yanından aşağı doğru ekleyin. Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar her bir veya iki kuyucuk için işlemi tekrarlayın.
   NOT: Damlaların kuyu ortasına eklenmesi, hücreleri yanlışlıkla alt tabakadan çıkarabilir.
3. Virüsü içeren PBS'nin her bir oyuktaki tüm tek hücre tabakasını kapladığından emin olmak için tüm plakayı elle hafifçe sallayın, ardından virüsün adsorbe olmasına izin vermek için plakayı 37 ° C'de bir CO₂ inkübatörüne yerleştirin.
4. 1 saat içinde her 10 dakikada bir, plakayı kuluçka makinesinden çıkarın, virüsü her bir oyuğa daha eşit bir şekilde yaymak için tekrar hafifçe sallayın ve ardından tekrar kuluçka makinesine yerleştirin.
   NOT: Her deney, kopya sayısını ve hangi seyreltmelerin kullanılacağını belirleyecektir; Okuyucunun tercihi bu kararı belirler.
5. Emilmeyen inokulumun yanlışlıkla sayılması olasılığını azaltmak için, virüs örneğini 1000 μL pipet uçlarıyla kuyucuklardan çıkarın ve bir atık kabına koyun.
   NOT: Yine, bu prosedür, hücre tek tabakasının hidrasyonunu korumak için bir seferde sadece bir veya iki kuyu ile gerçekleştirilir.
6. 2,5 mL metilselüloz kaplama yerleştirin (100 mL PBS'de %5 metilselülozu çözün, 121 ° C'de 15 dakika otoklav ve sıvı döngüsünde 15 psi, ardından 375 mL DMEM artı 25 mL FBS ekleyin).
7. Bir plakanın tamamı kaplama içerdiğinde, iki gün boyunca büyümeye izin vermek için plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
   NOT: Virüs ve hücrelerin üç gün boyunca büyümesine izin verilirse, DMEM plus takviyelerinde bile, tek tabakada önemli bir hücre kaybı meydana gelebilir ve böylece nihai verileri tehlikeye atabilir.
8. Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak çamaşır suyu, iyodofor veya benzer bir virüs öldürücü ilavesiyle dezenfekte edin.

4. Plaklar için boyama

1. İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz kaplamayı bir pipetle, her seferinde bir veya iki kuyucukla çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin.
2. Plakları lekelemek için her oyuğa %50 etanol içinde ~2 mL %1 kristal viyole (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
   NOT: Kaplamanın her son damlasını çıkarmak gerekli değildir.
3. Plakayı, leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bu noktada, atık kabı yukarıdaki adım 3.8'deki gibi dezenfekte edin.
4. Yüzey akışı berraklaşana kadar plakaları musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın.
   NOT: Yumuşak bir su akışı yeterince kuvvetli değildir; Bir laboratuvar lavabo armatüründen tam basınç gereklidir.
5. Bu noktada, her bir seyreltme serisinde plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun.
6. Plakaların gece boyunca baş aşağı kurumasına izin verin, ardından tek tek plaklar sayılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 oyuklu plakalar	Corning	3512
6 oyuklu plakalar	Corning	3516
Alfa-MEM	Fransa	12169F
Antibiyotik/antimikotik	Gibco (Gibco)	15240096
Kristal menekşe	Alfa Aesar	B2193214
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco (Gibco)	11965092
Dulbecco'nun PBS'si (Mg++ veya Ca++ yok)	Gibco (Gibco)	14190144
Fetal baldır serumu	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanil-L-glutamin (Glutamax)	Gibco (Gibco)	GS07F161BA
Hematidometre	Termo Balıkçı	02-671-54
Metilselüloz	Millipore-Sigma	27-441-0
Kuaterner ajan (Lysol I.C.)	Termo Balıkçı	NC9645698
Tripan Mavisi	Corning	25900CI
Tripsin	Sitiva	SH30042.01
Vero hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-81

Serisi