Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. TÜNEL TALILI
- Klinik chytridiomycosis belirtileri gösteren hayvanları ve eşit sayıda Bd-negatif kontrol hayvanını ötenazi yapın.
- Her hayvandan deri (sırt, ventral ve uyluk) örneklerini inceleyin. Deri örneklerini %4 v/v fosfat tamponlu formaldehit içinde 2 saat sabitleyin. Kısa ve tutarlı sabitleme süresi, dokuların tamamen sabitlenmesine izin verir, aynı zamanda etkili ve doğru immünohistokimya boyamasına da izin verir. Ardından, kesit alma için gömülene kadar% 80 etanole aktarın.
- Standart yöntemleri izleyerek histolojik hazırlık için cildi parafin mumuna gömün. Protokol kısaca şu şekildedir:
- Dokuları kademeli bir etanol serisinde kurutun ve etanolü ksilen ile temizleyin. Dokuyu parafin mumuna gömün ve her birey için üç cilt örneğini de bir parafin bloğuna yerleştirin.
- Standart histolojik hazırlığı takiben bir mikrotom kullanarak cildi kesit edin. Dokuyu 5 μm'de seri olarak bölümlere ayırın ve ardından hidrofilik cam slaytlara yapıştırın. Slayt başına cilt tipine göre dört seri histoseksiyon yerleştirin. Seri cilt bölümleri ile birey başına üç slayt yapın, her slaydın her dokunun dört bölümünün yapıştırıldığını unutmayın.
- Slaytları aşağıdaki sırayla boyayın:
- İlk slaydı hematoksilen ile boyayın, ardından eozin karşı boyama (H & E) yapın. Bu slayt, Bd sporangia'nın cilt içindeki yerini görselleştirmek içindir.
- Histolojik hazırlık için ticari olarak temin edilebilen bir TUNEL testini takiben ikinci slaydı boyayın ve aşağıda açıklanan üreticinin talimatlarını izleyin.
- İlk olarak, slaytları yıkama başına 5 dakika boyunca üç ksilen değişikliği ile yıkayarak bir coplin kavanozundaki doku bölümlerini deparafin edin ve ardından her yıkamada 5 dakika boyunca iki adet %100 etanol değişikliği yapın. 3 dakika boyunca %95 etanol ve ardından 3 dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın. 5 dakika boyunca bir yıkama PBS ile bitirin.
- Dokuyu taze seyreltilmiş protein sindiren enzim (PBS'de seyreltilmiş 20 μg / mL konsantrasyonda proteinaz K) ile ön işlemden geçirin ve doğrudan slayta ekleyin. 15 dakika inkübe edilmesine izin verin. Her biri 2 dakika boyunca bir coplin kavanozunda iki PBS değişikliği ile yıkayın.
- Fazla sıvıyı hafifçe vurun ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir coplin kavanozunda PBS'de% 3.0 hidrojen peroksit içinde söndürün. Her yıkamada beş dakika boyunca PBS ile iki kez durulayın.
- Fazla sıvıyı hafifçe vurun, ardından 75 μL / 5cm2 denge tamponunu doğrudan slayt üzerindeki dokuya uygulayın. 10 saniye kuluçkaya yatırın. Bölümün etrafındaki fazla sıvıyı hafifçe vurun ve 55 μL / 5cm2 çalışma terminali deoksinükleotidil transferaz (TdT) enzimi uygulayın. Nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- TdT inkübasyonundan sonra, slaytı çalışma gücü durdurma / yıkama tamponu olan bir coplin kavanozuna koyun, 15 saniye çalkalayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytı, yıkama başına 1 dakika boyunca üç PBS değişikliği ile yıkayın. Fazla sıvıyı hafifçe vurun.
- Oda sıcaklığına ısıtılmış anti-digoksigenin konjugatını (rodamin) dokuya 65 μL/5cm2 uygulayın. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ışığa maruz kalmaktan kaçının. Yıkama başına 2 dakika boyunca dört PBS değişikliği ile yıkayın. Fazla sıvıyı hafifçe vurun.
- Slayta slayt montaj ortamında 15 μL 0,5 - 1 μg/mL DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) ekleyerek bitirin, bu da karşı leke görevi görür. Daha sonra bir kapak astarı ile örtün ve oje veya kauçuk çimento ile kapatın. Tahlil ışığa duyarlı olduğu için slaytların karanlıkta kurumasına izin verin.
- TUNEL testi ve DAPI karşı boyasını kullanarak üçüncü slaydı boyayın, ancak her numune için pozitif ve negatif kontrol olarak kullanın.
NOT: Kontrol slaytlarındaki 4 histokesitten ilk 2'si pozitif kontrol replikaları ve son 2'si negatif kontrol replikalarıdır.
- Pozitif kontroller için, adım 1.5.2.2 yerine, dokuyu DN tamponu (30mM trizma bazı, pH 7.2, 4mM MgCl2, 0.1mM DDT) ile ön işleme tabi tutun ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra Dnase I'i 0.1ug / mL'lik bir son konsantrasyon için DN tamponunda çözün ve doğrudan slayta uygulayın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, slaytı her yıkamada 3 dakika boyunca 5 yıkama dH2O ile yıkayın. Fazla sıvıyı kurulayın. Ardından, bölüm 1.5.2.3'te belirtildiği gibi TUNEL testine devam edin.
- Negatif kontroller için, bu numunelere terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) enzimini eklemeyin (bölüm 1.5.2.4'te açıklandığı gibi).
2. Testin tamamlanmasının hemen ardından TUNEL slaytlarını gözlemleyin.
- Floresan mikroskobu kullanarak 200X'te her cilt bölümü boyunca rastgele aralıklarla fotoğraf çekin, hem apoptotik hücreleri ortaya çıkaran ve kırmızı görünen rodamin lekesi hem de tüm çekirdekleri ortaya çıkaran ve mavi görünen DAPI için filtreler kullanın, böylece bir hücre tabakası oluşturulabilir. Örnek başına cilt bölümü başına en az 100 hücrenin fotoğraflandığından emin olun. Slaytları -20 °C'de koyu renkli bir mikroskop kutusunda saklayın.
- Görüntü başına hücre sayısı (mavi DAPI lekeli). Cilt bölümü başına en az 100 hücre sayıldığından emin olun. 100 hücreye ulaşmak için görüntüdeki tüm hücreleri sayın. Bir görüntüde 100'den az hücre varsa, hayvan başına deri bölümü başına en az 100 hücreye ulaşılana kadar başka bir görüntü sayın.
- Ardından, aynı görüntülerdeki TUNEL pozitif hücrelerin sayısını sayın (kırmızı rodamin lekeli). Nekroz veya arka plan değil, apoptozu gösteren TUNEL-pozitif hücreler, açık hücre kenarlarına sahip tek hücrelerdir (zarlar parçalanma olmadan sağlamdır). Bazen hücreler apoptotik cisimler oluşturmak için küçülür.
- TUNEL tahlilinde sayılan alanları bulun ve H&E boyalı histokesitlerde karşılık gelen bölgeleri analiz edin. H & E ile boyanmış bölümlerin Bd enfeksiyonu bölgelerine karşılık geldiğini onaylayın, bu da TUNEL testinde apoptotik hücreleri sayarken Bd ile enfekte olmuş bölgelerin kullanılmasını sağlar.
