Kaspaz-3/7 Testi: Kurbağa Derisi Eksplantlarında Kaspaz-3/7 Aktivitelerini Ölçerek Apoptozu Ölçmek İçin Lüminesans Tabanlı Bir Test

Özet

Kaynak: Brannelly, LA ve diğerleri, Chytridiomycosis'li Kurbağalarda Epidermal Hücre Ölümünü Ölçmek için Terminal Transferaz Aracılı dUTP Nick Uç Etiketleme (TUNEL) ve Kaspaz 3/7 Tahlillerini Kullanma. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, hücre ölümünü veya apoptozu ölçmek için in vitro Kaspaz-3/7 ışıldayan bir test açıklanmaktadır. Test, ışıldayan bir DEVD substratının kaspaz-3/7 bölünmesini takiben üretilen lüminesansı ölçer. Üretilen lüminesans, kaspaz-3/7 aktivitesi ile orantılıdır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hayvan Yetiştiriciliği ve Gözlemciliği

1. Hayvanları tek tek, türe uygun bir ortamda, uygun bir su, besleme ve temizlik programı ile barındırın. Hayvanları günlük olarak kontrol edin.
   1. Tehdit altındaki Litoria verreauxii alpina'nın (Kaspaz 3/7 testi için, Bölüm 4) esaret altındaki yetiştirme tesislerinden bağışlanan yetişkin bireylerini kullanın. Hayvanları 15 - 18 ° C'de, yosun ve çakıl bir alt tabakada tutun, her gün ters ozmoz s....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
KUTUP Yıldızı Omega	BMG Laboratuvar Teknolojisi		Lüminesan plaka okuyucu
384 kuyu düz şeffaf alt plaka	Corning	3707
384 kuyulu düşük flanşlı beyaz düz tabanlı plaka	Corning	3570 Adet
Agar Bakteriyolojik (Oksoit)	balıkçı	OXLP0011B
Laktoz Suyu (Oksoit)	balıkçı	OXCM0137B
Sodyum Bikarbonat	balıkçı	BP328-500
Trikan-S (MS-222)	balıkçı	NC0872873
Tripton	balıkçı	BP1421-500
Sığır Serumu Albümini	Canlandırıcı	15561020
Steril suni ipek çubuk	Tıbbi Tel ve Ekipman	MW-113
Coomassie Bradford reaktifi	delmek	23200
Kaspaz Glo 3/7	Promega	G8090
HEPES tamponu	Sigma-Aldrich	H0887-20ML
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	1374248-1G
Jelatin hidrolizat Enzimatik	Sigma-Aldrich	G0262
PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Sağ), pH 7.2 (1X)	Termo/Yaşam	20-012-043
Hazırlayıcı	Termo/Yaşam	4318930
TaqMan Hızlı Gelişmiş Master Karışımı	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	4444556
Clorox çamaşır suyu	Clorox Gölü
Etanol, 200 Kanıt, Moleküler Sınıf	balıkçı	BP2818500
ZEISS Axio Scan floresan mikroskop	Carl Zeiss		Floresan mikroskobu
3.2mm paslanmaz çelik boncuklar	Biyo Spec (Biyo Özellik)	11079132SS
Astar ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)	Takman		Astarlar ve prob için özel tasarım
Astar 5.8S Chytr (5 ′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3 ′)	Takman		Astarlar ve prob için özel tasarım
Küçük oluk bağlayıcı probu Chytr MGB2 (5 "-CGAGTCGAAC-3")	Takman		Astarlar ve prob için özel tasarım
Rotor-Gene qPCR Cihazları	Keçi		qPCR makinesi
Mikrosantrifüj tüpleri 1.5ml	balıkçı	02-681-372
Hücre kültürü petri plakaları	Nunc (Rahibe)	263991
Mini boncuk Çırpıcı Zircornia-Silikat Boncuklar, 0,5 mm	Biyo Spec (Biyo Özellik)	11079105Z

Serisi Serisi Serisi Fuar Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi ·