Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvan Yetiştiriciliği ve Gözlemciliği
- Hayvanları tek tek, türe uygun bir ortamda, uygun bir su, besleme ve temizlik programı ile barındırın. Hayvanları günlük olarak kontrol edin.
- Tehdit altındaki Litoria verreauxii alpina'nın (Kaspaz 3/7 testi için, Bölüm 4) esaret altındaki yetiştirme tesislerinden bağışlanan yetişkin bireylerini kullanın. Hayvanları 15 - 18 ° C'de, yosun ve çakıl bir alt tabakada tutun, her gün ters ozmoz suyu ile buğulayın ve haftada 3 kez bağırsak yüklü cırcır böcekleri ile besleyin.
- Her birey hakkında haftada bir kez veri toplayın. Adım 2.1'de açıklandığı gibi bireyleri Bd için sürüntü. Bir ölçek kullanarak her bir hayvanı yaklaşık 0,1 g'a kadar tartın ve kadranlı kaliperler kullanarak burunlarını havalandırma (SVL) uzunluğunu en yakın 0,01 mm'ye kadar ölçün.
- Aşılamadan sonra (Bölüm 3'te açıklandığı gibi), hayvan etiği yönergelerine uygun olarak hayvanları klinik enfeksiyon belirtileri (düzensiz deri dökülmesi, iştahsızlık, bacak kızarıklığı, uyuşukluk veya gecikmiş düzeltme refleksi) açısından günlük olarak kontrol edin. Klinik belirtiler ve morbidite varsa hayvanlara ötenazi yapın.
- Aşırı dozda trikain metansülfonat (MS222) ile ötenazi yapın (yaşlı musluk suyunda sodyum bikarbonat ile pH 6 - 7'ye kadar %0.1 w/v MS222). Tüm hareketler durduktan ve uyaranlara tepki göstermedikten sonra hayvanları 10 dakika MS222'de tutun.
2. Bd Enfeksiyonu Testi
- Bd için sürüntü
- Her hayvanı yeni bir steril suni ipek çubukla (hayvan başına bir çubukla) temizleyin. Aşağıdaki temizleme yöntemini kullanın: ventilde beş kez ve her uyluk, yan ve uzuvda beş kez. Bu toplam 45 vuruştur.
- DNA'nın etkili bir şekilde yakalanmasını sağlamak için swabı vuruşlar sırasında ve vuruşlar arasında hafifçe döndürün. Swab ucunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve ekstraksiyona kadar -20 ° C'de saklayın.
- DNA Ekstraksiyonu ve qPCR testi
- 30 - 40 mg 0.5 mm silika boncuk ile ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon reaktifinden 50 μL ekleyerek swablardan genomik DNA'yı çıkarın. Boncuk, numuneleri bir boncuk çırpıcı hücre bozucuda 2 dakika boyunca maksimum hızda çırptı. Boncuk çırpıcı adımını takiben, numuneleri 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.
- Numuneleri 100 °C'de 10 dakika inkübe edin ve soğumaya bırakın. Numuneleri 3 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve qPCR'ye kadar -20 ° C'de saklayın.
- Enfeksiyon yükünü analiz etmek için Boyle ve ark. 2004'e göre kantitatif PCR (qPCR) kullanın. Aşağıdaki değişiklikleri kullanın:
- DNA ekstraksiyon örneklerini 6:100 oranında çift deiyonize su ile seyreltin. PCR inhibisyonunu önlemeye yardımcı olmak için her oyuğa 0.7 μL sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Her örneği tekil olarak çalıştırın. Her plakada, zoospor (enfeksiyon) yükünü tahmin etmek için bir negatif (şablon yok) kontrol ve bir dizi seyreltme standardına sahip pozitif bir kontrol kullanın.
3. Aşılama
- Kültür Bd
- 1 L deiyonize suya 16 g tripton, 2 g jelatin hidrolizat ve 4 g laktoz (TGHL) ekleyerek kültür suyu hazırlayın. Otoklavlayın (40 dakika boyunca 121 °C) ve et suyunun soğumasını bekleyin.
- Bd izolatını (bu durumda, Yeni Güney Galler izolatından izole edilmiştir, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Pasaj numarası 11) bir TGHL suyuna aşılayın ve 23 ° C'de 7 gün büyütün, ardından et suyu kültürünü TGHL agar plakalarına aktarın.
- Plaka yapmak için 1 L deiyonize su ve otoklava (40 dakika boyunca 121 °C) 16 g tripton, 2 g jelatin hidrolizat, 4 g laktoz (TGHL) ve 10 g bakteriyolojik agar ekleyin. Karışım dokunacak kadar soğuduktan sonra, ancak katılaşmadan önce, TGHL agar'ı Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde 1/4 ila 1/3 oranında dolu olacak şekilde 92 mm çapındaki kültür plakalarına dökün.
- Agar katılaştığında ve tamamen soğuduğunda, her bir plakayı sıvı et suyundan 0,5 mL Bd ile aşılayın ve eşit şekilde yayın. Bd suyu karışımının bir plaka üzerinde yaklaşık 1 saat kurumasını bekleyin ve ardından plakaları plastik parafin film ile kapatın. Plakaları agar tarafı aşağı bakacak şekilde 23 °C'de 5 - 7 gün inkübe edin.
- Zoospor aşılama çözeltisi için taşkın plakaları
- Aşılamadan önce günlük olarak canlılığı sağlamak için ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında zoospor hareketliliğini kontrol edin. Zoospor salınımı yüksek olduğunda, birçok zoospor sporangia'nın dışında yüzerken, kültür aşılamaya hazırdır.
- Zoosporların suya salınmasını sağlamak için suyu tabağa dökerek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek her bir plakayı 3 mL yaşlı musluk suyu veya yapay havuz suyu ile doldurun. Kuluçka döneminden sonra, zoospor süspansiyonunu yeni bir steril kaba boşaltın.
- Bir hemositometre kullanarak üreticinin talimatlarını izleyerek zoospor konsantrasyonunu tahmin edin. Zoospor süspansiyonunun konsantrasyonu bilindiğinde, süspansiyonu yaşlı musluk suyu ile 3 mL'de 1 x 106 zoospor konsantrasyonuna seyreltin.
- Hayvanları aşılayın
- Her bir hayvanı, 50 mL'lik ayrı kaplarda otomatının üzerine 3 mL aşı karışımı dökerek aşılayın. Fazla aşının aşılama kabının tabanına toplanmasına izin verin. Enfeksiyonu sağlamak için her hayvanı 24 saat boyunca ayrı bir aşılama kabında bırakın ve 24 saatlik aşılamadan sonra her bireyi dezenfekte edilmiş bir teraryuma geri koyun.
- Terria'yı %13 hacim/hacim (h/h) ticari ağartma solüsyonu kullanarak dezenfekte edin, en az iki kez suyla durulayın, ardından en az 24 saat kurumaya bırakın.
- Bd negatif kontroller için, hayvanları 3.2 - 3.3'teki gibi aynı yöntemleri kullanarak sahte aşılayın, ancak Bd içermeyen agar plakalarını Bd ile aşılanmış agar plakaları yerine 5 mL yaşlı musluk suyu ile doldurun.
4. Kaspaz 3/7 Testi
- Her hayvandan (hem Bd'ye maruz kalan hem de Bd-negatif) aşılamadan sonraki 3. haftaya kadar haftada bir ve deneyin sonuna kadar iki haftada bir, birey başına 8 ayak parmağına kadar ayak parmakları toplayın.
- Parmak ucunu alevle sterilize edilmiş makasla ikinci falankstan kesin ve 1,5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin ve hemen -80 °C'de dondurun.
- Donmuş ayak parmağı örneğinden proteinleri çıkarın.
- Numuneleri, 1,5 mL vidalı kapaklı bir mikrotüp içinde iki paslanmaz çelik boncuk (3,2 mm) ile 100 μL numune tamponuna (25 mM HEPES pH7, 5 mM MgCl 2) yerleştirin. Lyse, maksimum hızda (adım 1.2.1'de kullanılanla aynı boncuk çırpıcıda) 1 dakikalık 4 döngü boncuk çırparak ve ardından buz üzerinde 3 dakika ile numune alır. Lizizden sonra, numuneleri 12.000 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Tahlilde kullanmak için süpernatan toplayın.
- Bradford testini kullanarak numune başına protein konsantrasyonunu ölçün.
- 384 oyuklu bir plakada, 10 μL protein ekstraktını 10 μL Bradford reaktifi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. Her numuneyi, bir dizi 5 katlı BSA seyreltme standardı ile birlikte iki kez gerçekleştirin. 595 nm'de absorbansı bir absorbans plakası okuyucusunda okuyun.
- Alternatif olarak, ayak ucu numuneleri çok küçükse (protein konsantrasyonu Bradford testinden belirlenen en düşük standarda yakınsa veya numune alınan kurbağalar toplam ağırlığı 3 g'ın altındaysa), Bradford testi yerine fotoğrafları kullanarak cilt yüzey alanını tahmin ederek numuneleri standartlaştırın.
- Kaspaz tahlili için numuneden proteinleri çıkarmadan önce, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak her bir parmağı 40X büyütmede fotoğraflayın.
- Ayak parmağının alanını tahmin ederek, bilgisayar görüntüleme yazılımı kullanarak ayak parmağı örneğini analiz edin. Bunu, ayak klipsinin kenarına bir çizgi çizerek yapın ve görüntüleme yazılımının şekil içindeki alanı tahmin etmesini sağlayın. Daha sonra bu alanı, 3 boyutlu deri örneğinin yüzey alanına yaklaşık olarak yaklaşacak olan pi (3.14) ile çarpın (uzunluk x kesit alanı (pi x çap) bir tüpün dış yüzey alanını verir).
- Kaspaz 3/7 testini gerçekleştirin.
- 384 oyuklu bir lüminesans plakasına, 10 μL ticari olarak temin edilebilen kaspaz 3/7 reaktifi ve 10 μL protein özütü ekleyin. Her örneği üç kopya halinde çalıştırın.
- Plakayı 15 saniye boyunca yavaşça sallayarak reaktifleri karıştırın. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika ışıktan uzakta inkübe edin. Lüminesansı bir plaka okuyucu kullanarak ölçün.
