Fagositoz Testi: Drosophila melanogaster'in Embriyonik Hücrelerinde Apoptotik Hücre Yutulmasını Görselleştirmek İçin Bir İmmün Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Nonaka, S. et al. Drosophila embriyolarında apoptotik hücreler için fagositoz testi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, Drosophila melanogaster'in homojenize embriyonik hücrelerinde apoptotik hücre yutulmasını görselleştirmek için bir immün boyama tekniğini göstermektedir. Bu yöntem, apoptotik hücre yutulmasının derecesini belirleyerek hücresel fizyoloji hakkında bilgi sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hemositlerin Boyanması

1. Anti-Croquemort antikoru ile immün boyama
   1. Cam slaytları seri olarak 10 dakika metanol içinde, %0,2 (h/h) Triton X-100 içeren PBS'de 10 dakika ve ardından PBS'de 10 dakika bekletin.
   2. Bloke etmek için hücrelere% 0.2 (h / h) Triton X-100 içeren PBS'ye 20 μL% 5 (h / v) tam domuz serumu monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
   3. Çözeltiyi cam slaytlardan çıkarın ve hücrelere% 0.2 (h / h) Triton X-100 içeren PBS'ye 20 μL anti-Croquemort antiserum (% 0.1 (h / h)) monte edin. Slaytları gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   4. % 0.2 (h / h) Triton X-100 içeren PBS'de 10 dakika 5 kez ıslatın.
   5. Cam slaytları PBS'de 10 dakika bekletin.
   6. %0,2 (h/h) Triton X-100 ve %5 (h/h) tam domuz serumu içeren PBS'ye 20 μL alkalin fosfataz etiketli anti-sıçan IgG (%0,5 (h/h)) monte edin.
   7. % 0.2 (h / h) Triton X-100 içeren PBS'de 10 dakika 5 kez ıslatın.
   8. Cam slaytları 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ve 50 mM MgCl2 içeren tamponda 10 dakika bekletin.
   9. 0.23 mg / mL 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP), 0.35 mg / mL nitro mavi tetrazolyum (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ve 50 mM MgCl₂ içeren fosfataz substrat çözeltisini hücreler üzerinde monte edin.
   10. Uygun boyama için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hemosit granüllerinde güçlü mor sinyaller göründüğünde, substrat çözeltisini çıkarın ve cam slaytları 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 ve 1 mM EDTA'dan oluşan tampona batırın. Yaklaşık 5 - 10 dakika boyama önerilir.

2. Apoptotik Hücreleri TUNEL ile Stain

1. Cam slaytları PBS'de 5 dakika bekletin.
2. Yeni PBS ile tekrarlayın.
3. Dengeleme tamponunu (Malzeme Tablosuna Bakın) hücrelere 10 dakika boyunca monte edin.
4. Çözeltiyi cam slaytlardan çıkarın ve 5 μL terminal deoksinükleotidil transferaz ve 15 μL Reaksiyon Tamponu içeren 20 μL TdT çözeltisini 37 ° C'de 1 saat boyunca hücrelere monte edin.
5. Çözeltiyi cam slaytlardan çıkarın ve slaytları 0,5 mL STOP/Wash tamponu ve 17 mL sudan oluşan tampona batırın.
6. Slaytları PBS'de 3 kez 5 dakika bekletin.
7. 20 μL Anti-Digoksigenin-Peroksidaz'ı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücrelere monte edin.
8. Cam slaytları PBS'de 5 dakika 4 kez bekletin.
9. Cam slaytları 30 mL 50 mM Tris-HCl, 3,3'-diaminobenzidin tetrahidrklorür (DAB) tam bir mikro spatula içeren pH7.5 ve 30 saniye boyunca %0.002 (h/h) H₂O₂'den oluşan peroksidaz substrat çözeltisine batırın.
10. Apoptotik hücreler kahverengiye boyanana kadar yukarıdaki adımı tekrarlayın. Peroksidaz reaksiyonunu durdurmak için cam slaytları suya batırın.
11. Gözlem için hücreleri suyla kapatın.

3. Apoptotik Hücrelerin Fagositoz Seviyesini Ölçün

1. Fagositoz seviyesini değerlendirmek için numuneleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Croquemort pozitif hücreleri veya GFP pozitif hücreleri hemositler, TUNEL pozitif hücreleri apoptotik hücreler ve çift pozitif hücreleri fagositoz hemositler olarak sayın.
2. Fagositik indeks, çift pozitif hücrelerin sayısının toplam Croquemort pozitif hücre veya GFP pozitif hücre sayısına oranı olarak tanımlanır. 300'den fazla hemosit görülmesi önerilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
bütün domuz serumu	MP Biyomedikal	55993	Engellemek için
Kpl Anti-Sıçan IgG (H + L) Ab MSA, AP	KPL (Türkçe)	475-1612	bir anti-Croquemort antikoru ile lekelenmiş hemositler için ikincil antikor
5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat	Roche	11383221001	BCIP, Hemositlerin boyanması için
nitro mavisi tetrazolyum	Roche	11383213001	NBT, Hemositlerin boyanması için
Anti-Croquemort antikoru			daha önce Manaka ve diğerleri, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Apop Tag Peroksidaz Yerinde Apoptoz Tespit Kiti	Kırlangıç	S7100 Serisi	Apoptoitc hücrelerinin boyanması için. Bu kit, Dengeleme tamponu, Reaksiyon tamponu, STOP/Wash tamponu, TdT enzimi ve Anti-Digoksigenin-Peroksidaz içerir.
3,3'-diaminobenzidin tetrahidriklorür	Nacalai Tesque	11009-41	DAB, Apoptoitk hücrelerinin boyanması için