Fagositoz Testi: Drosophila melanogaster'in Embriyonik Hücrelerinde Apoptotik Hücre Yutulmasını Görselleştirmek İçin Bir İmmün Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Nonaka, S. et al. Drosophila embriyolarında apoptotik hücreler için fagositoz testi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, Drosophila melanogaster'in homojenize embriyonik hücrelerinde apoptotik hücre yutulmasını görselleştirmek için bir immün boyama tekniğini göstermektedir. Bu yöntem, apoptotik hücre yutulmasının derecesini belirleyerek hücresel fizyoloji hakkında bilgi sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hemositlerin Boyanması

1. Anti-Croquemort antikoru ile immün boyama
   1. Cam slaytları seri olarak 10 dakika metanol içinde, %0,2 (h/h) Triton X-100 içeren PBS'de 10 dakika ve ardından PBS'de 10 dakika bekletin.
   2. Bloke etmek için hücrelere% 0.2 (h / h) Triton X-100 içeren PBS'ye 20 μL% 5 (h / v) tam domuz serumu monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
   3. Çözeltiyi cam slaytlardan çıkarın ve hücrelere% 0.2 (h / h) Triton X-100 içeren PBS'y....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
bütün domuz serumu	MP Biyomedikal	55993	Engellemek için
Kpl Anti-Sıçan IgG (H + L) Ab MSA, AP	KPL (Türkçe)	475-1612	bir anti-Croquemort antikoru ile lekelenmiş hemositler için ikincil antikor
5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat	Roche	11383221001	BCIP, Hemositlerin boyanması için
nitro mavisi tetrazolyum	Roche	11383213001	NBT, Hemositlerin boyanması için
Anti-Croquemort antikoru			daha önce Manaka ve diğerleri, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Apop Tag Peroksidaz Yerinde Apoptoz Tespit Kiti	Kırlangıç	S7100 Serisi	Apoptoitc hücrelerinin boyanması için. Bu kit, Dengeleme tamponu, Reaksiyon tamponu, STOP/Wash tamponu, TdT enzimi ve Anti-Digoksigenin-Peroksidaz içerir.
3,3'-diaminobenzidin tetrahidriklorür	Nacalai Tesque	11009-41	DAB, Apoptoitk hücrelerinin boyanması için