$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. THP-1 Monosit Hücre Hattının Kültürü ve Hazırlanması
- Kültür THP-1 monositleri, 37 ° C +% 5 CO2'de T25 şişelerinde bir süspansiyon kültürü olarak. Hücreler 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) +% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) içinde büyütülmelidir.
- Her gün, şişeyi hafifçe sallayarak hücreleri büyüme ortamı boyunca eşit şekilde askıya alın, ardından hemen bir hemositometre ile hücreleri sayın. Hücre yoğunluğu 1 x 106 hücre / mL'ye ulaştığında hücreler geçilmelidir:
- 37 °C su banyosunda RPMI 1640 + FBS'yi önceden ısıtın.
- 2 x 105 hücreyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne veya 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve pelet hücrelerini oda sıcaklığında 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek aktarın.
- Hücre peletini bozmadan süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL (1.5 mL mikrosantrifüj tüpü) veya 5 mL (15 mL konik tüp) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.
- Tüpü oda sıcaklığında 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan PBS'yi çıkarın.
- Peletleri 1 mL taze RPMI 1640 +% 10 FBS içinde yeniden süspanse edin.
- Yeni bir T25 şişesine 4 mL ısıtılmış ortam yerleştirin ve buna 1.2.5'ten yeniden askıya alınmış hücreleri ekleyin. 37 ° C +% 5 CO2 inkübatöründe, hücrelerin pasajlanması gerekene kadar (tipik olarak 3 gün) veya bir deney için hücreler gerekli olana kadar kültür.
- THP-1'den türetilmiş makrofajlarla yapılan bir deney için, geçmeden önce şişeden ve plakadan gerekli sayıda hücreyi çıkarın:
- Gerekli sayıda 18 mm dairesel cam lamel (# 1.5 kalınlık) 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin - tipik olarak koşul ve / veya zaman noktası başına 1 lamel . Her kuyucuk alikotuna 5 x 104 THP-1 monositleri. Gerekirse her bir kuyucuğa eklenen hücre sayısı değiştirilebilir.
- 37 ° C'ye ısıtılmış RPMI +% 10 FBS kullanarak hücre içeren her bir kuyucuğun toplam hacmini 1 mL'ye getirin.
- Her oyuğa 100 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ekleyin ve THP-1 monositlerinin makrofaj benzeri hücrelere farklılaşmasını indüklemek için 3 gün boyunca kültürleyin.
2. J774.2 Makrofaj Hücre Hattının Kültürü ve Hazırlanması
- T25 şişelerindeki J774.2 hücrelerini 37 ° C +% 5 CO2'de kültürleyin. Hücreler 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) +% 10 FBS'de büyütülmeli ve kültür% 80-90 birleşmeye ulaştığında geçilmelidir. Hücreleri geçmek için:
- Tüm ortamı şişeden çıkarın ve 5 mL PBS ile bir kez yükseltin.
- PBS'yi şişeden çıkarın ve 5 mL taze DMEM +% 10 FBS ile değiştirin.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak, ortamdaki hücreleri askıya almak için şişenin altını kazıyın. Herhangi bir hücre agregasını parçalamak için hücreleri birkaç kez kuvvetlice pipetleyin.
- Şişeden 4 mL hücre süspansiyonunu çıkararak ve 4 mL taze ortam ile değiştirerek hücreleri 1: 5 oranında seyreltin. Kalan hücre süspansiyonu atılabilir, taze bir T25 şişesinde yeni bir hücre kültürü başlatmak için kullanılabilir veya bir deney için kullanılabilir.
- J774.2 hücrelerini kullanarak bir efferositoz testi hazırlamak için:
- Deneyin başlamasından bir gün önce, J774.2 hücrelerini 1.1.1–1.1.3 adımlarına göre 5 mL taze ortama askıya alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve gerekli hücre hacmini 5 x 104 hücre / mL konsantrasyonda hazırlayın.
- Gerekli sayıda 18 mm dairesel cam lamel (# 1.5 kalınlık) 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Her bir kuyucuğa, 5 x 104 hücre / mL hücre süspansiyonunun 1 mL'sini alikot edin.
- Hücrelerin lamele yapışmasına ve geçişten kurtulmasına izin vermek için gece boyunca kültürleyin.
3. Birincil İnsan M2 Makrofajlarının Kültürü
- Gerekli olan her 12 oyuklu M2 makrofaj plakası için 10 mL heparinize insan kanı toplayın.
- 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 5 mL önceden ısıtılmış Lenfolit-poli hücre ayırma ortamının üzerine 5 mL insan kanı katmanlayın. Daha büyük hacimli tüpler kullanmak yerine >5 mL kan işliyorsanız, birden fazla tüp hazırlayın.
- 300 x g'da 35 dakika boyunca, orta ivme kullanarak ve ara vermeden santrifüjleyin.
- Plastik bir pipetleyici kullanarak üst mononükleer hücre açısından zengin bandı dikkatlice çıkarın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Adım 3.2'de birden fazla tüp hazırlandıysa, bantlar tek bir 50 mL'lik tüpte toplanabilir. PBS ile tüp hacmini 50 mL'ye kadar getirin.
- 300 x g'da 8 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Bu adım sırasında, otoklavlanmış 18 mm çapında dairesel lameller (# 1.5 kalınlık) 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin.
- Hücre peletini istenen sayıda kuyucuk başına 300 μL serumsuz RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin; örneğin, tam 12 oyuklu bir plaka hazırlamak için 10 mL kan işlendiyse, hücre peletini 3.6 mL ortamda askıya alın.
- 12 oyuklu plakadaki her bir lamel içeren oyuğa 300 μL hücre süspansiyonu ekleyin. 37 °C +% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
- Yapışmayan hücreleri çıkarmak için lamel 3x'i 1 mL ısıtılmış PBS ile nazikçe yıkayın.
- 1 mL RPMI 1640 +% 10 FBS + 10 ng / mL rekombinant insan M-CSF + hücre kültürü antibiyotik / antimikotik ekleyin. 37 °C +% 5 CO2'de 5 gün inkübe edin.
- Ortamı RPMI 1640 +% 10 FBS + 10 ng / mL rekombinant insan M-CSF + 10 ng / mL rekombinant insan IL-4 + hücre kültürü antibiyotiği / antimikotik ile değiştirin. M2 polarizasyonunu tamamlamak için 37 °C + %5 CO2'de 2 gün inkübe edin.
- Polarize makrofajlar önümüzdeki 3 gün içinde kullanılmalıdır.
4. Apoptotik Jurkat Hücrelerinin Hazırlanması
- 37 ° C'de 5 mL RPMI 1640 +% 10 FBS +% 5 CO2'de Jurkat hücrelerini kültürleyin. Jurkatlar bir süspansiyon hücre hattıdır ve her 3-5 günde bir taze, önceden ısıtılmış ortama 1:5 oranında geçirilerek korunabilir.
- Apoptotik hücreleri hazırlamak için, Jurkat kültürünün yüksek yoğunluğa ulaşmasına izin verin (geçtikten 4-5 gün sonra). 1.5 mL'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ve pelet hücrelerini 500 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleme ile
alikot edin.
- Süpernatanı atın ve 1 μM staurosporin içeren 1 mL serumsuz RPMI 1640 ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücreleri apoptotik hale getirmek için 37 ° C +% 5 CO2'de 16 saat inkübe edin.
- İstenirse, Annexin V ile boyayarak apoptozun indüksiyonunu onaylayın:
- 100 μL staurosporin ile muamele edilmiş Jurkat hücre kültürünü 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri, süpernatanı atın ve hücre peletini 100 μL serumsuz RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
- 1 μL floresein izotiyosiyanat (FITC) ile konjuge Annexin V ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 900 μL PBS ekleyin ve tüm hacmi 18 mm dairesel cam lamel (# 1.5 kalınlık) içeren 12 oyuklu bir plakanın tek bir kuyusuna aktarın. Hücreleri lamele yapışmaya zorlamak için 200 x g'da bir plaka adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde 1 dakika boyunca döndürün. Alternatif olarak, hücreler görüntüleme için odacıklı bir slayta yerleştirilebilir.
- Floresan mikroskobu kullanarak görüntü.
5. Sabit Hücreli Efferositoz Testi ve İçten Dışa Boyama Kullanarak Efferositik Alım ve Dinamiklerin Ölçülmesi
- THP-1, J774.2 veya M2 insan makrofajlarını sırasıyla Bölüm 1-3'te açıklandığı gibi hazırlayın.
- Deneyin başlamasından önceki akşam, Bölüm 4'te anlatıldığı gibi apoptotik Jurkat hücrelerini hazırlayın.
- Deneyden hemen önce, bir hemositometre kullanarak apoptotik hücreleri sayın. Yeterli sayıda apoptotik hücreyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın – genellikle 5 x 105 hücre / kuyu ekleriz, bu da 10: 1'lik bir hedef: efferosit oranı sağlar.
- Pelet Jurkat hücrelerini 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleme ile ve 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
- Santrifüjleme sırasında, 10 μL DMSO'yu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne alın. Minimal miktarda N-hidroksisüksinimidobiotin (NHS-Biotin) DMSO'da çözün. 5-10 kristal (~ 0.005 mg) yeterlidir.
- 500 μL apoptotik hücre / PBS süspansiyonunu DMSO / NHS-biotin içeren tüpe aktarın. Ardından, bir hücre izleme boyasını üreticinin tavsiye ettiği konsantrasyona kadar apoptotik hücre süspansiyonuna seyreltin. FITC-Streptavidin ile spektral olarak örtüşmeyen bir hücre izleme boyası seçtiğinizden emin olun (örneğin, kırmızı veya uzak kırmızı hücre izleme boyası).
- Süspansiyonu karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Eşit hacimde RPMI 1640 +% 10 FBS ekleyin ve reaksiyona girmemiş boyayı söndürmek için karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri, süpernatanı atın ve boyanmış apoptotik hücreleri makrofaj oyuğu başına 100 μL RPMI 1640 +% 10 FBS'de yeniden askıya alın.
- Her bir makrofaj oyuğuna damla damla 100 μL lekeli apoptotik hücre süspansiyonu ekleyin. Makrofajlar ve apoptotik hücreler arasındaki teması zorlamak için bir plaka adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde 1 dakika boyunca 200 x g
santrifüjleyin.
- Plakayı bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C +% 5 CO2 'de istenen süre boyunca inkübe edin. Makrofajlar için, efferositozlu materyal genellikle ilk olarak 20-30 dakika sonra tespit edilebilir ve 120-180 dakika sonra tamamlanır.
- İstenilen zaman noktasında/noktalarında hücreleri inkübatörden çıkarın. Efferositozu durdurmak ve efferositozlu olmayan apoptotik hücreleri çıkarmak için hücreleri 1 mL oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın.
- Her bir oyuğa 1: 1.000 oranında seyreltmede FITC konjuge streptavidin ekleyin ve karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Bu, maruz kalan biyotini herhangi bir efferositoz edilmemiş apoptotik hücre materyali üzerinde etiketleyecektir.
not: İstenirse, hücre çekirdekleri bu aşamada 1: 20.000 seyreltme Hoechst 33342 veya 4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür (DAPI) ilavesiyle boyanabilir.
- Hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın, numuneleri durulama başına 5 dakika boyunca hafifçe sallayın veya sallayın. Hücreleri %4 paraformaldehit (PFA) ile PBS'de oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin. Fazla PFA'yı gidermek için hücreleri PBS ile bir kez durulayın.
- Lameller görüntüleme için bir slayt üzerine monte edin ve bir floresan mikroskobuna aktarın. Doğru niceleme için yeterli sayıda hücrenin z yığınlarını yakalayın - tipik olarak koşul başına 10-30 hücre. İçselleştirilmemiş apoptotik hücre materyali, ortaya çıkan görüntüde, FITC-streptavidin boyaması ile sarılmış hücre izleme boyası etiketli materyal olarak görünür olurken, efferositozlu materyal, herhangi bir streptavidin boyası içermeyen ayrı hücre izleme boyası punkta oluşturur.
- Elde edilen görüntülerdeki efferositozu çeşitli önlemlerle ölçün:
- Makrofaj başına ortalama ayrık efferozom sayısını (hücre izleme boyası+/streptavidin-puncta) belirleyerek efferositik indeksi hesaplayın. Yalnızca apoptotik bir hücreye bağlı veya ≥1 görünür efferozom içeren makrofajları ölçün. Apoptotik bir hücreye bağlı, ancak ayrık efferozomlardan yoksun makrofajları, efferositik indeksi 0 olarak kaydedin.
- ≥1 efferozom içeren makrofajların fraksiyonunu ölçerek efferositik verimliliği hesaplayın.
- Birden fazla zaman noktasında sabitlenmiş ve boyanmış hücreleri görüntüleyerek efferositoz oranını hesaplayın. Yalnızca apoptotik hücrelere bağlı veya görünür efferozomlar içeren, her hücrenin z-yığınları yakalanan makrofajları görüntüler. Görüntülendikten sonra efferositoz oranını belirleyin:
- Streptavidin boyamayı bir kılavuz olarak ve FIJI/ImageJ'deki (veya başka bir görüntü analiz yazılım paketindeki) serbest el veya çokgen seçim aracını kullanarak, tüm hücre izleme boyası + / streptavidin- (örneğin içselleştirilmiş) malzemesini z-yığınının tek bir düzleminde daire içine alın. Bu bölgedeki hücre izleme boyasının entegre yoğunluğunu ölçün. Her efferozom için ayrı ölçümler (örn. çap, hücre sınırına veya çekirdeğe göre konumlandırma, vb.) bu ölçümlerle aynı anda kolayca elde edilebilir ve analiz sırasında toplanan verileri büyük ölçüde artırır.
- Aynı z-kesitinde, streptavidin boyamayı bir kılavuz olarak ve serbest el veya çokgen seçim aracını kullanarak, tüm hücre izleme boyası + / streptavidin + (örn. içselleştirilmemiş) malzemesini z yığınının tek bir düzleminde daire içine alın. Sadece fagosit ile temas halinde olan apoptotik hücrelerden boyamayı içerir. Bu bölgenin entegre yoğunluğunu ölçün.
- Görüntünün kalan z bölümleri için 4.2.3.1 ila 4.2.3.2 arasındaki adımları tekrarlayın. Efferositozlu (Σeff) ve efferositozlu olmayan (Σne) malzemelerin entegre yoğunluğunu toplayın. Efferositoz edilmiş apoptotik hücrenin fraksiyonu hücre için şu şekilde hesaplanabilir:
- Tüm zaman noktalarında tüm hücreler için efferositozlu fraksiyonu ölçün. Apoptotik hücrelerin/efferozomların floresan yoğunluğunun, tek tek apoptotik hücreler tarafından hücre izleme boyalarının alımındaki farklılıklar ve maruz kalma süresi gibi görüntü elde etme parametrelerindeki değişiklikler nedeniyle görüntüler arasında değişebileceğini unutmayın. Bu nedenle, yalnızca Fraksiyon Efferositoz gibi normalleştirilmiş değerleri veya efferositik indeks ve efferositik verimlilik gibi yoğunluktan bağımsız değerleri, görüntüler arasında, deneysel koşullar arasında ve tekrarlanan deneyler arasında karşılaştırın.
- Elde edilen veri setinin hücreler arasındaki efferositozdaki değişimi doğru bir şekilde yansıttığından emin olmak için, bu analizleri her deneyde mümkün olan maksimum hücre sayısı üzerinde gerçekleştirin.
not: Efferositik verimlilik ve efferositik indeks hızlı bir şekilde hesaplanabilir (birkaç saniye / hücre) ve tipik olarak deney başına en az 100 hücreyi analiz etmeyi ve her deneyi en az 3 kez tekrarlamayı hedefleriz. Efferositozlu materyalin fraksiyonunun hesaplanması ve efferozoma özgü ölçümler daha zahmetlidir ve deneyimli bir analist için tipik olarak 2-3 dakika/hücre sürer. Bu hesaplamalar için, deney başına koşul başına en az 15 hücreyi ölçeriz.
- Hücre bazında efferositik indeks, fraksiyon efferositoz ve bireysel efferozom verilerini kaydedin.
not: Bu, tek hücreli yaklaşımlar kullanılarak veri analizine izin verir, böylece hücreler arası varyasyonların nicelleştirilmesine izin verir. Bireysel deneylerde elde edilen tek hücreli verilerin ortalaması alınarak bu veri kümeleri üzerinde popülasyon düzeyinde analizler hala yapılabilir. Efferozoma özgü ölçümler, popülasyon düzeyinde, tek hücre düzeyinde ve topluluklar olarak (örneğin, onları içeren hücrelerden bağımsız efferozom popülasyonları olarak) analiz edilebilir.