Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Medyanın hazırlanması
- Temel oosit toplama ortamını ve oosit olgunlaşma ortamını yapmak için Tablo 1'de açıklandığı gibi tüm bileşenleri ekleyin. Temel toplama ortamı için pH'ı 7.4'e ayarlayın. Hem toplama hem de olgunlaşma ortamı için, kullanım gününde 3 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 μM silostamid ekleyin.
2. Ypet-3' UTR ve mCherry için mRNA kodlamasının hazırlanması
- İlgilenilen mRNA'ların 3' UTR dizilerini elde edin.
not: Bu çalışma için daha önce fare oosit cDNA'sından diziler elde edildi.
- Oosit cDNA'sından ve pcDNA 3.1 vektörünün bir Ypet kodlama dizisi, V5-epitop etiketi ve bir T7 promotörü içeren kısımlarından hedef 3' UTR'leri amplifiye etmek için primerler tasarlayın.
- Yüksek kaliteli bir DNA polimeraz kiti kullanarak amplifiye edin. Parçaların doğru boyutta olup olmadığını kontrol etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerini bir jel üzerinde çalıştırın, bantları kesin ve üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı jelden çıkarın.
- Bir PCR klonlama kiti kullanarak PCR parçalarını bir vektöre birleştirin.
not: PCR fragmanları, daha verimli bir rekombinasyon sürecini kolaylaştırmak için 4 saat boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Bu, yalnızca 45 dakikalık bir kuluçka süresi öneren üreticinin talimatlarına aykırıdır.
- PCR fragmanlarını yetkin 5 α Escherichia coli bakterisine aktarın.
- Karışımı ve plazmidi bakterilere ekleyin ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Karışımı 42 °C'de 45 saniye boyunca bir su banyosuna koyarak karışımı ve plazmidi ısıtın ve hemen 3 dakika buz üzerinde soğutun.
- Katabolit baskılama (SOC) ortamı ile 500 μL Süper Optimal et suyu ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 2 dakika boyunca 7000 × g'da döndürün ve süpernatantın çoğunu çıkarın. Uygun seçilmiş antibiyotik ile bir Luria Broth (LB) agar plakası üzerinde yeniden askıya alın ve plaka.
not: Bu çalışmada karbenisilin kullanıldı.
- Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kolonilerden birine bir pipet ucunu hafifçe bastırarak ve 100 μg / mL karbenisilin ile 3 mL LB ortamına yerleştirerek kolonileri izole edin. 37 °C'de 12-24 saat inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarına göre plazmit DNA izolasyon kitini kullanarak plazmitlerin DNA'sını çıkarın ve dizileri DNA dizilimi yoluyla onaylayın.
- Ypet/3' UTR için:
- İn vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu oluşturun. Ypet dizisinin yukarı akışında bir ileri astar ve 20 ek timin kalıntısı içeren bir ters astar kullanın. Ypet/IL-7 3' UTR dizisi ve ileri ve geri primerlerin dizileri için Tablo 2'ye bakınız.
not: Bu ek timin kalıntıları, in vitro transkripsiyondan sonra doğrusal mRNA'ya oligo(A) ekleyecektir.
- İn vitro olarak, üreticinin talimatlarına göre bir T7 transkripsiyon kiti kullanarak PCR ürününü yazıya dökün.
- Elde edilen tamamlayıcı RNA'yı (cRNA) üreticinin talimatlarına göre bir transkripsiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın.
- Saflaştırılmış cRNA'yı RNAse içermeyen suda elute edin, konsantrasyonu ölçün ve agaroz elektroforezi ile bütünlüğü değerlendirin. -80 °C'de saklayın.
- mCherry için:
- Yüksek kaliteli bir kısıtlama enzimi kullanarak in vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu oluşturun; bu örneği tekrarlıyorsanız kısıtlama enzimi mfEI-HF'yi kullanın. Gece boyunca 37 °C'de bir sindirim tamponunda sindirin.
- Numuneyi saflaştırmak için bir jel çalıştırın ve üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak doğrusal DNA'yı çıkarın.
- İn vitro olarak, üreticinin talimatlarına göre bir T7 transkripsiyon kiti kullanarak PCR ürününü yazıya dökün.
- cRNA'yı (150-200 nükleotid) üreticinin talimatlarına göre bir poli(A) atık kiti kullanarak poliadenil.
- Elde edilen cRNA'yı, üreticinin talimatlarına göre bir transkripsiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın.
- Saflaştırılmış cRNA'yı RNAz içermeyen suda elute edin, mRNA konsantrasyonlarını ölçün ve jel elektroforezi ile mesaj bütünlüğünü değerlendirin. -80 °C'de saklayın.
3. Deneysel prosedür
NOT: Oosit mikroenjeksiyonu ve müteakip hızlandırılmış mikroskopi ile ilgili şematik bir genel bakış Şekil 1'de verilmiştir.
- 1. Gün
- Folikül büyümesini antral aşamaya teşvik etmek için intraperitoneal olarak 21 günlük farelere 5 IU hamile kısrak serumu gonadotropin enjekte edin.
- 3. Gün
- Oosit toplanması
- 26 G'lık bir iğne ile folikül duvarında küçük bir kesi yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağızla çalıştırılan bir cam pipet kullanarak sağlam kümülüs ile çevrili oositleri (COC'ler) birkaç kat kümülüs hücresi ile izole edin.
- Daha küçük bir pipet kullanın (oositin çapından biraz daha büyük) ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak denüle edin.
not: Alternatif olarak, sağlam COC'ler üzerinde mikro enjeksiyon yapın.
- Daha büyük bir pipet kullanarak, soyulmuş oositleri aspire edin ve mayotik olgunlaşmanın yeniden başlamasını önlemek için 1 μM fosfodiesteraz inhibitörü, silostamid ile desteklenmiş bir olgunlaşma ortamı olan bir Petri kabına yerleştirin. Oositlerin, oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulmasını sağlamak için çanağı 2 saat boyunca inkübatöre koyun.
- Oosit mikro enjeksiyonu
- Mekanik bir çektirme içine 10 cm uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirerek enjeksiyon iğnelerini hazırlayın. Optimum enjeksiyon için, ısıtılmış bir filament kullanarak iğne ucunu 45°'lik bir açıyla bükün.
- 20 μL bazik oosit toplama ortamı damlacıkları ile polistiren tabaklar hazırlayın ve damlacıkları hafif mineral yağ ile kaplayın.
- 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR ve 12,5 μg/μL mCherry ekleyerek bir raportör karışımı hazırlayın. Benzer raportör konsantrasyonlarını sağlamak için daha büyük bir hacim hazırlayın ve gelecekteki deneyler için alikotlar yapın. Bu alikotları -80 °C'de saklayın. Çözüldükten sonra, önce alikotu 20.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
not: Bu santrifüjleme, enjeksiyon iğnesinin raportör karışımındaki potansiyel agregalar tarafından tıkanmasını önleyecektir.
- Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 μL raportör karışımı ile kılcallık ile yükleyin.
- Tutma pipetini ve yüklü enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığına yerleştirin. Ortamın bir kısmını tutma pipetine aspire edin.
- Enjeksiyon iğnesini, tutma pipetine hafifçe vurarak açın.
- Oositleri bir bazik toplama ortamı damlacığına yerleştirin ve raportör karışımının 5-10 pL'sini enjekte edin.
- mCherry sinyalinin platoya ulaşmasını sağlamak için olgunlaşma ortamındaki oositleri 1 μM silostamid ile 16 saat inkübe edin.
- Enjekte edilen her raportör için en az iki adet 20 μL olgunlaşma ortamı damlası ile hızlandırılmış mikroskopi için kullanılacak bir Petri kabı hazırlayın: profaz I-tutuklanan oositleri kontrol etmek için 1 μM silostamid içeren bir damlacık ve olgunlaşan oositler için silostamid içermeyen bir damlacık. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.
- Hızlandırılmış mikroskopi
- Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve silostamid içermeyen olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Profaz I ile tutuklanan oosit kontrol grubu olarak bazı oositleri 1 μM silostamid ile olgunlaşma ortamında tutun.
- Enjekte edilen oositleri önceden hazırlanmış hızlandırılmış mikroskop kabı üzerindeki ilgili damlacıklarına aktarın. Kapalı bir cam pipet kullanarak yumurtaları kümeleyin (ucu birkaç saniye alevde tutarak kapalı bir pipet hazırlanabilir).
not: Oositlerin kümelenmesi, kayıt sırasında hareketlerini önlemeye yardımcı olur.
- Çanağı, ışık yayan bir diyot aydınlatma sistemi ve 37 ° C ve% 5 CO2'de tutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Bu çalışmayı tekrarlamak için aşağıdaki parametreleri kullanın: filtre seti: dikroik ayna YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP kanalı (Uyarma (Ex): S500 / 20 × 49057; Emisyon (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanalı (Örn: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Hızlandırılmış deney için uygun ayarları girin (bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosuna bakın): Uygulamalar | Çok Boyutlu Satın Alma. İlk sekmeyi seçin Ana ve timelapse, çoklu aşama konumları ve çoklu dalga boylarını seçin.
- Denemenin kaydedilmesi gereken konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin.
- Zaman noktası sayısını, süreyi ve zaman aralığını girmek için Timelapse sekmesini seçin.
not: Hızlandırılmış deneyin süresi, oosit mayotik olgunlaşmasının zamanlaması türler arasında farklılık gösterdiğinden, incelenen hayvan türüne bağlıdır. Fare oositleri ile yapılan bu deneyde, oositler 16 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedildi.
- Sekmeyi seçin Aşama. Brightfield'ı açın ve Al | öğesini seçerek yeni bir pencere açarak oositlerin konumunu bulun. Edinme | Canlı Göster. Oositler yerleştirildikten sonra, Çok Boyutlu Alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için + tuşuna basın.
- Dalga boyları sekmesini seçin ve parlak alan (pozlama 15 ms), YFP (Ypet/IL7 3' UTR için pozlama 150 ms) ve mCherry (Ypet/IL7 3' UTR için pozlama 75 ms) için 3 farklı dalga boyu ayarlayın.
not: Her bir Ypet/3' UTR muhabiri için pozlamayı, muhabir birikimi seviyesine ve enjekte edilen hacme göre ayarlayın. Çevirinin etkinleştirilmesi durumunda hafife almayı veya doygunluğu önlemek için deneyin başlangıcında YFP sinyalinin algılama aralığının ortasına düştüğünden emin olun. mCherry için, sinyal poliadenilasyon prosedürü sırasında eklenen adenin nükleotidlerinin sayısına bağlı olduğundan, her bir mCherry partisi için maruziyeti ayarlayın. Poliadenilasyon verimliliğindeki değişiklik nedeniyle, deneyler arasında daha iyi bir karşılaştırma yapmak için farklı deneylerde aynı mCherry partisini kullanın.
- Al'a tıklayarak hızlandırılmış deneyi başlatın. Tek bir oositte hızlandırılmış kayıt örneği için Şekil 1'e bakın.
- Ypet-3' UTR çevirisinin analizi
- Bu analiz için (bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosuna bakınız), her oosit için iki bölge ölçümü gerçekleştirin: oositin kendisi - elips bölgesine tıklayın ve oositi çevreleyin - ve arka plan çıkarma için kullanılacak oosite yakın küçük bir bölge - dikdörtgen bölgeye tıklayın.
not: Hızlandırılmış kayıt sırasında oositlerin seçilen bölgenin dışına çıkmadığından emin olun. Bölge ölçümünün polar cisim ekstrüzyonu etrafındaki yerleşimine özellikle dikkat edin, çünkü bu oositte harekete neden olur ve kaydı bozabilir.
- Veri analizi yazılımını dışa aktarmak için önce Günlüğü Aç'a ve ardından Günlük Verileri'ne tıklayarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya aktarın.
- Her bir oosit için ve ölçülen tüm zaman noktaları için, arka plan bölgesi ölçümünü oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Bunu YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı yapın.
Tablo 1: Ortamın hazırlanması. Temel oosit toplama ortamı ve oosit olgunlaşma ortamı hazırlamak için eklenmesi gereken bileşenlerin listesi.
| Temel oosit toplama ortamı | |
| parça | 500 mL için |
| HEPES modifiyeli Minimum Esansiyel Orta Kartal | 7.1 gr |
| Sodyum bikarbonat | 252 mg |
| Sodyum piruvat | 1,15 mL |
| Penisilin / Streptomisin 100x | 5 mL |
| Ultra saf damıtılmış su (Invitrogen, 10977-015) | 500 mL'ye kadar |
| Olgunlaşma ortamı | |
| parça | 500 mL için |
| MEM alfa 1x | 500 mL'ye kadar |
| Sodyum piruvat | 1,15 mL |
| Penisilin / Streptomisin 100x | 5 mL |
Tablo 2: Raportör ve primer dizileri örneği İn vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu oluşturmak için kullanılan YFP/IL7 3'UTR raportör dizisi ve ileri ve geri primer dizileri.
| sıra |
| Ypet/İnterlökin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGGCGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGGCGAGGGCACCTACGGCAAGCTGACCCTGCTGAAGCTGCTGCTGCACCACCGGCAAGCT |
| İleri astar | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Ters astar | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT |
