Bağırsak Asitlenmesi İzleme Testi: Bromofenol Mavi Boya Kullanarak Drosophila'da Bağırsak Lümeninin Asitlenmesini İncelemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Abu, F., et al. Yetişkin Drosophila bağırsağında bağırsak asitlenmesinin izlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, Drosophila sineklerinde bağırsak asitlenmesini izlemek için yapılan bir testi göstermektedir. pH indikatör boyası ile takviye edilmiş gıdaların yutulmasından sonra, bağırsak lümeninin asitleşmesi boyanın renginde bir değişikliğe neden olur. Renk değişimini incelemek için sineklerin sindirim sisteminin görsel olarak incelenmesi, asitleşmenin kanıtını sağlar.

Protokol

NOT: WT kontrolü olarak standart laboratuvar hattı Oregon R kullanılmıştır. Tüm sinekler standart mısır unu-pekmez ortamında (pekmez, agar, maya, mısır unu, tegosept, propiyonik asit ve su içeren) oda sıcaklığında 12/12 saat açık/koyu sirkadiyen ritimle yetiştirildi.

1. Test için hazırlanıyor

1. CO₂ anestezisi altında dişi sinekleri (0-2 günlük, bakire olmayan) toplayın ve deneylerden önce en az 3 gün boyunca standart mısır unu yemi üzerinde iyileşmelerine izin verin.
2. ~2 mL deiyonize su ile ıslatılmış laboratuvar mendil dokusu içeren şişelerde sinekleri oda sıcaklığında (~ 23 ° C) ~ 24 saat aç bırakın.
3. Bromofenol mavisi (BPB) içeren sinek yemini aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. Sinek yemini bir mikrodalgada eritin ve ılık olana kadar soğumaya bırakın.
   2. 1 mL ılık yiyeceğe 1 mL %4 BPB ekleyin ve iyice karıştırın.
   3. Bir pipet kullanarak, BPB içeren sinek yemini bir Petri kabının ortasındaki tek bir noktaya (~ 200 μL) ekleyin.

2. Bağırsak asitlenmesi izleme testi

1. Aç sinekleri,% 2 bromofenol mavisi (BPB) ile desteklenmiş tek nokta (200 μL) sinek yemi içeren bir Petri kabına aktarın. Sineklerin ışığa maruz kaldıklarında oda sıcaklığında 4 saat boyunca yiyecek aramalarına izin verin.
2. 4 saat sonra, sinekleri toplayın ve buz üzerinde uyuşturun; bağırsaklarını cerrahi olarak izole edin.
   1. Ameliyatı stereomikroskop altında forseps ile 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Göğüs kafesini bir çift forseps ile tutarak ve bağırsağın CCR'si görünene kadar ikinci bir çift ile karnı aşağı çekerek bağırsağı izole edin, bağırsağın her iki ucunda da bağlı kalmasını sağlamaya özen gösterin.
3. Bağırsağın CCR'sinin rengini inceleyerek bağırsağın asitlenmesini belirleyin (Şekil 1C; sarı asitlenmiş ve mavi asitleşmemiş olduğunu gösterir).
4. Sadece bağırsaklarında sağlam BPB lekelenmesi gösteren sinekleri sayın.
5. Aşağıdaki denklemi kullanarak yüzdeyi hesaplayın:
   Asitlenmiş bağırsaklara sahip sineklerin yüzdesi = asitlenmiş sinek sayısı × 100 / (asitlenmiş sinek sayısı + asitlenmemiş sinek sayısı)
   not: 0'lık bir yüzde, hiçbir sineğin bağırsaklarını asitlendirmediğini, yüzde 100'lük bir yüzde ise tüm sineklerin bağırsaklarını asitleştirdiğini gösterir.

Sonuçlar

Şekil 1: Bağırsak asitlenmesinin izlenmesi.(A) Besleme alanının şematik çizimi. Mavi nokta, bromofenol mavisi (pH gösteren bir boya) içeren sinek yemini temsil eder. Diğer lekeler meyve sineklerini temsil eder. (B) 4 saat boyunca farklı süreler boyunca beslenen bağırsak asitlenmesini gösteren sineklerin yüzdesinin grafiksel gösterimi. Asitlenmiş bir bağırsağın ve asit...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bromofenol mavisi	Sigma-Aldrich		B0126
D. simulanlar	Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Drosophila Tür Stok Merkezi		Nehir Kenarı, Kaliforniya1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Drosophila Tür Stok Merkezi		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. yalancı obscura	Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Drosophila Tür Stok Merkezi		Eugene, Oregon (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Drosophila Tür Stok Merkezi		Çikolata Dağları, Kaliforniya (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forseps	Inox Biyoloji		Katalog# 11252-20
Kim mendil mendil	Kimtech A.Ş.
Oregon R	Bloomington Drosophila Hisse Senedi		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri kapları	Balıkçı Bilimsel		Katalog #FB0875713A
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	HyClone (Klon		Katalog # SH30258.01
Stereomikroskop	Olimpos SZ51		Görsel büyütme

Gazetesi Serisi ) dijital fotoğraf makinesi