Mitokondriyal Kalsiyum Alım Testi: İzole Mitokondride Kalsiyum Alımını Ölçmek İçin Plaka Okuyucu Tabanlı Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Maxwell, J.T., et al., İzole Mitokondri ve Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Akışının Analizleri. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, izole mitokondride mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için plaka okuyucu tabanlı bir test açıklanmaktadır. Tahlil, mitokondriyal kalsiyum alımının ve aşırı kalsiyum yükünün kinetiğini incelemek için kalsiyuma duyarlı bir floresan boyanın floresan sinyalini analiz eder.

Protokol

1. Reaktifler ve Çözeltiler

1. Mitokondriyal izolasyon için 500 mL MS-EGTA tamponu yapın: 225 mM mannitol, 75 mM sükroz, 5 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA), pH KOH ile 7.4'e ayarlanmış. 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce MS-EGTA tamponunun 4 °C'ye önceden soğutulduğundan emin olun.
2. 100 mL KCl Tamponu hazırlayın: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA ve KOH ile pH 7.2'ye ayarlanmış. Oda sıcaklığında saklayın.
3. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde ....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Synergy Neo2 Enjektörlü çok modlu mikroplaka okuyucu	Biyotek
Doku Homojenizatörü	Kimble	886000-0022
96 oyuklu plaka	Corning	3628
Kalsiyum Yeşili-5N	Canlandırıcı	C3737
DMSO (Türkçe)	Canlandırıcı	D12345
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H3375
EGTA (EGTA)	Sigma	E8145
Potasyum klorür	balıkçı	BP366-500
Magnezyum klorür	Sigma	M2670
Sodyum piruvat	Sigma	P2256
L-malik asit	Sigma	M1125
Kalsiyum klorür	Sigma	C4901
Potasyum fosfat monobazik	Sigma	P0662 Serisi

adet Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi