$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Reaktifler ve Çözeltiler
- Mitokondriyal izolasyon için 500 mL MS-EGTA tamponu yapın: 225 mM mannitol, 75 mM sükroz, 5 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA), pH KOH ile 7.4'e ayarlanmış. 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce MS-EGTA tamponunun 4 °C'ye önceden soğutulduğundan emin olun.
- 100 mL KCl Tamponu hazırlayın: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA ve KOH ile pH 7.2'ye ayarlanmış. Oda sıcaklığında saklayın.
- Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1 mM kalsiyum yeşili-5N stoğu hazırlayın. Kalsiyum yeşili-5N stoğu kesilebilir ve -20 ° C'de saklanabilir.
- Yüzeyleri Ca2+ alımı için hazırlayın.
- 1 M sodyum piruvat hazırlayın, pH 7.4. -20 °C'de alikotlar halinde saklayın.
- 500 mM malat, pH 7.4 hazırlayın. -20 °C'de alikotlar halinde saklayın.
2. Kardiyak Mitokondri İzolasyonu
- Fareyi kurumsal standartlara göre ötenazi yapın.
not: Kurumsal olarak onaylanmış ötenazi yöntemimiz için, fareler izofloran inhalasyonu ile uyuşturuldu ve servikal çıkık ile feda edildi.
- Göğüs boşluğunu açarak, kaburgaların her iki tarafını keserek, kalbi çevreleyerek, diyaframı keserek ve kalp dokusunu eksize ederek kalbi toplayın.
not: Bu protokolde, yetişkin bir fareden toplanan tüm kalpten (yaklaşık 120 mg) mitokondriyal izolasyon gerçekleştirilir ve bu da 3-4 deney için yeterli olmalıdır. Karaciğer gibi diğer mitokondri açısından zengin dokulardan mitokondriyal izolasyon için, açıklanan protokolü takiben 200 mg'a kadar doku kullanılabilir.
- Dokuyu 25 mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iyice durulayın ve tüm kanın ventriküllerden sıkıldığından emin olun.
not: Kalpten sıkılan sıvı berraklaştığında kalp yeterince durulanacaktır.
- Bir çift keskin makas kullanarak kalbi 5 mL buz gibi 1x PBS'de küçük parçalar halinde doğrayın.
- PBS'yi atın ve kıyılmış kalp dokusunu 0,10 ila 0,15 mm aralıklarla önceden soğutulmuş 7 mL cam Teflon Dounce homojenizatöre aktarın.
- 5 mL buz gibi soğuk MS-EGTA tamponu ekleyin ve doku parçaları artık görünmeyene kadar (yaklaşık 11 vuruş) numuneyi homojenize edin.
not: Amaç sağlam ve fonksiyonel mitokondri elde etmek olduğu için dokuyu aşırı homojenize etmeyin.
- Homojenatı 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Homojenatı 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri peletlemek için santrifüjleyin.
- Süpernatanı 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve 10,000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca pelet mitokondriye santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve mitokondriyal peleti buz üzerinde tutun.
- Mitokondriyal peleti buz gibi MS-EGTA tamponu kullanarak iki kez yıkayın. Her yıkama için, mitokondriyal peleti 5 mL MS-EGTA tamponunda yeniden süspanse edin, 10 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Son yıkamadan sonra, süpernatanı atın ve mitokondriyi 100 μL buz gibi soğuk MS-EGTA tamponunda yeniden süspanse edin. Mitokondriyi buz üzerinde tutun.
not: Mitokondri 1 saat içinde deney için kullanılmalıdır.
- Bradford Protein Testi kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün.
3. Mitokondriyal Kalsiyum Alımının Plaka Okuyucu Tabanlı Ölçümü
NOT: Burada, enjektörlerle donatılmış çok modlu bir plaka okuyucu kullanılarak mitokondriyal Ca2+ alımını analiz etmek için protokol açıklanmaktadır. Reaksiyonu ışıktan korumak için otomatik reaktif enjektörleri ile kinetik modda kalsiyum yeşili-5N floresan (506/532 nm uyarma/emisyon) okuma yeteneğine sahip herhangi bir plaka okuyucu kullanılabilir.
- Plaka okuyucuyu, toplam 1.000 s'lik bir tahlil süresi boyunca her saniye alınan ölçümlerle kalsiyum yeşili-5N floresan kinetik okuması yapacak şekilde programlayın. Ek olarak, reaktif enjektörlerini 30 s, 150 s, 300 s, 480 s ve 690 s zaman noktalarında 5 μL CaCl2 çözeltisi dağıtacak şekilde programlayın.
not: CaCl2 enjeksiyonlarının zamanlaması kullanıcı tanımlıdır ve deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir.
- Reaktif enjektörlerini kullanılacak CaCl2 çözeltisi ile doldurun.
not: CaCl2 çözeltisinin konsantrasyonu kullanıcı tanımlıdır ve MPTP açılmasını tetiklemek için gereken Ca2+ miktarını titre etmek için sonraki çalışmalarda ayarlanabilir.
- 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna 200 μg mitokondri ekleyin.
- Mitokondri ve KCl tamponunun toplam hacmi 197 μL'ye gelecek şekilde kuyuya uygun hacimde KCl tamponu ekleyin.
- Mitokondri karışımına 1 μL 1 M piruvat ve 1 μL 500 mM malat ekleyin. Karıştırmak için nazikçe pipetleyin ve mitokondrinin enerjilenmesini sağlamak için mitokondriyi alt tabakalarla oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
- 1 μL 1 mM kalsiyum yeşili-5N stoğu ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
not: Kalsiyum yeşili-5N boyasının eklenmesini takiben reaksiyonu ışıktan koruyun.
- Önceden programlanmış kinetik protokolü başlatın ve kalsiyum yeşili-5N floresansını izleyin.