1. Büyük Unilamellar Veziküllerin (LUV'ler) Hazırlanması
- LUV'leri, floresan sızıntı tahlili için hücre zarı taklitçisi olarak kullanımları için hazırlayın.
- Bir Hamilton cam şırınga fosfatidilkolin (DOPC, 786.11 g / mol), sfingomyelin (SM, 760.22 g / mol) ve Kolesterol (Chol, 386.65 g / mol) ile molar oranda 4: 4: 2 oranında karıştırın. Lipid çözeltisi, 25 mL'lik bir cam yuvarlak tabanlı şişede 25 mg / mL'de bir metanol / kloroform (3/1; hacim / hacim) çözücü içinde çözündürülen her bir lipitin bir stok çözeltisinden elde edilir. 4 μmol DOPC, 4 μmol SM ve 2 μmol Chol bazlı lipid çözeltisi, sırasıyla 126 μL, 117 μL ve 31 μL karıştırılarak stok çözeltiden elde edilir.
Dikkat: Metanol toksik ve yanıcı bir çözücüdür ve kloroform toksik ve kanserojendir. Her ikisi de bir başlık altında uygun koruma ile ele alınmalıdır.
- Metanol / kloroformu, kurutulmuş bir lipit filmi oluşana kadar 60 ° C'de 45-60 dakika boyunca vakum altında döner bir buharlaştırıcı kullanarak buharlaştırın.
- İki stok HEPES tampon çözeltisi hazırlayın. 20 mM HEPES (238.3 g/mol) ve 75 mM NaCl (58.44 g/mol) karıştırarak HEPES tamponu 1'i hazırlayın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. 20 mM HEPES ve 145 mM NaCl'yi karıştırarak HEPES tamponu 2'yi hazırlayın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. HEPES tamponları 4 °C'de 1 ay süreyle saklanabilir.
not: Tamponların ozmolaritesini bir ozmolikmetre kullanarak kontrol etmeniz önerilir.
- Membran geçirimsiz floresan boya-söndürücü çifti, 8-aminonaftalin-1, 3, 6-trisülfonik asit, disodyum tuzunu 12.5 mM'de (ANTS, 427.33 g/mol) ve p-ksilen-bipiridinyum bromürü 45 mM'de (DPX, 422.16 g/mol) çözerek lipid hidrasyon çözeltisi hazırlayın. Karıncaları DPX ile karıştırmak sarı renkli bir çözeltiye yol açar. 12.5 mM ANTS ve 45 mM DPX konsantrasyonlarını elde etmek için, sırasıyla 21.4 mg ve 76 mg'ı 4 mL HEPES tamponu 1.
içinde çözün
not: Lipid hidrasyon solüsyonu, tüpün alüminyum folyo ile sarılmasıyla 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
- Kurutulmuş lipid filmi 1 mL lipid hidrasyon çözeltisi ile yeniden süspanse ederek ve kurutulmuş lipid filminin çözünmesine kadar girdap yaparak çok katmanlı vezikülleri (MLV) sulandırın. Küçük lipid agregatları önceki adımları olumsuz etkileyeceğinden, çözeltinin tamamen çözündüğünden emin olun. Ayrıca, kalan lipit filmi olmadığından emin olmak için cam yuvarlak tabanlı şişenin duvarını kontrol edin.
not: Çözelti, çözündürüldükten sonra yanardöner ve açık sarı görünecektir.
- Uniilamellar veziküller elde etmek için vezikülleri beş donma/çözülme döngüsüne tabi tutun. Her döngüyü, cam yuvarlak tabanlı şişeyi dondurma adımı için 30 saniye sıvı nitrojen içine koyarak ve ardından çözme adımı için 2 dakika su banyosunda bırakarak gerçekleştirin.
not: Banyo suyunun sıcaklığı, lipitlerin erime sıcaklığından 5-10°C daha yüksek olmalıdır.
- Metal ekstrüder bidonuna yerleştirilen her bir politetrafloroetilen (PTFE) ekstrüder parçasına HEPES tamponu ile önceden nemlendirilmiş iki filtre desteği yerleştirerek lipid ekstrüderi hazırlayın.
- Bir filtre desteğinin üstüne bir HEPES nemlendirilmiş polikarbonat membran (0,1 μm gözenek boyutu, 25 mm çap) yerleştirin.
- İki metal ekstrüder bidonunu birleştirin ve vidalayın.
- Monte edilmiş ekstrüderi tutucuya yerleştirin ve her bir politetrafloroetilen ekstrüder parçasının ucundaki uygun deliğe 1 mL'lik bir şırınga yerleştirin. Ekstrüzyon, test edilen sıvının bir şırıngadan diğerine polikarbonat membrandan geçişine karşılık gelir.
- Herhangi bir sızıntı veya sorun olmadığından emin olmak için ekstrüderi 1 mL şırıngadan birine yüklenmiş 1 mL HEPES tamponu ile test edin.
- 1 mL HEPES tamponunu MLV ile değiştirin.amp.
- Aynı boyutta tek tip LUV'ler elde etmek için MLV numunesini bir şırıngadan diğerine polikarbonat membrandan en az 21 kez geçirerek ekstrüzyon gerçekleştirin.
not: Ekstrüzyon, lipit karışımının erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklıkta yapılmalıdır.
2. LUV'lerin saflaştırılması
- Kapsüllenmemiş ANTS ve DPX fazlalığını gidermek için bir kolon saflaştırması hazırlayın.
- Bir sıvı kromatografi kolonunda (Luer Kilidi, Ceketsiz, 1.0 cm x 20 cm, yatak hacmi 1.0 mL) % 0.01 NaN3 (65 g / mol) ile sulu ortamda yeniden süspanse edilmiş çapraz bağlı dekstran jeli (G-50) ekleyin kolonun renksiz kısmının üst kısmının 1 cm altına kadar.
- Musluğu açın ve çapraz bağlı dekstran jeli çökeltmek için sıvının akmasına izin verin.
- Kolonu 20 mL HEPES tamponu 2 ile ayrıştırarak yıkayın ve kolonun çıkış akışını atın.
- Kolonun üzerindeki ölü çözücü hacmi en aza indirildiğinde (<100 μL), ancak çapraz bağlı dekstran jelin herhangi bir kurumasını önlemek için yeterli olduğunda musluğu kapatın.
- Taze ekstrüde edilmiş LUV'leri (sarı) sütuna yerleştirin ve çapraz bağlı dekstran jelin içine girmelerine izin verin.
- LUV saflaştırmasını gerçekleştirmek için kolona sürekli olarak HEPES tamponu 2 ekleyin.
- Yaklaşık 2 mL HEPES tamponu 2 verin (çapraz bağlı dekstran jelin kurumasını önlemek için kolonun üst kısmını düzenli olarak doldurmayı unutmayın): serbest sarı ANTS ve DPX çözeltisi lipozomlardan daha yavaş göç eder.
- Saflaştırılmış LUV'leri tüplerde (1,5 mL) toplamaya başlayın.
- Kolondan eluent damlalarını gözlemleyin ve yanardöner hale geldiklerinde lipozomlar içerirler. LUV içeren fraksiyonu geri kazanmak için tüpü değiştirin.
- Damlalar artık yanardöner olmayana kadar (~ 1 mL) elute edin. Daha sonra, ayrı bir fraksiyonda 0.5 mL daha elüte edin ve ardından elüsyonu durdurun.
NOT: Standartlar artık LUV'lerin elüsyon hacmini kalibre etmek için kitler veya ayrı moleküler ağırlıklar olarak çok çeşitli moleküler ağırlıklarda mevcuttur.
- Floresan boyanın ağarmasını önlemek için tüpleri LUV'lerle birlikte alüminyum folyoya sarın.
- Kolonu 20 mL HEPES tamponu 2 ile yıkayın.
- LUV'ler daha sonra 4 °C.
'de bir hafta boyunca saklanabilir
NOT: LUV stabilitesi, LUV konsantrasyonuna ve bileşimine ve ayrıca iyonik kuvvete bağlı olabileceğinden, LUV'lerin boyutu bir dinamik ışık saçılımı (DLS) cihazı kullanılarak kontrol edilmelidir (bkz. bölüm 4. LUV Boyutu ve Homojenliğinin Karakterizasyonu) her testten önce.
3. LUV'lerin konsantrasyonunun ölçülmesi
- Kolin konsantrasyonunun değerlendirilmesini sağlayan bir fosfolipid miktar tayin kiti ile LUV konsantrasyonunu tahmin edin. Bu test, kolin içeren polar başlı fosfolipidler önemli olduğunda (LUV'lerin %>50'si) uygulanabilir.
- 18 mg kromojen substratı sağlanan 3 mL tampon içinde çözerek renk reaktifini hazırlayın.
- 3 mL renk reaktifi ile 10 x 10 x 45 mm'lik bir polistiren küvet yükleyin.
- Saf renk reaktifini boş koşul (Boş) olarak kullanın. 20 μL LUV numunesi (Test) veya bilinen kolin konsantrasyonunun (Standart) 20 μL standart çözeltisini ekleyin.
- İyice karıştırın ve tüm koşullarda (Boş, Test ve Standart) 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Test numunesinin ve standart çözeltinin absorbansını (optik yoğunluk, OD) bir spektrofotometre ile 600 nm'de kontrol olarak boş çözelti ile ölçün.
- LUV'lerin lipid konsantrasyonunu, C[LUV], bilinen konsantrasyon standardına kıyasla kolin eşdeğeri olarak tahmin etmeyi sağlayan OD değerlerini kontrol edin.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplamayı gerçekleştirin:
C[LUV] (mol / l) = (OD Numunesi / OD Standardı) x C[Standart] (mol / l)
NOT: Fosfolipid miktar tayin kiti, C [Standart] = 3.87 mmol / L'nin molar konsantrasyonuna karşılık gelen 54 mg / dL'de bir Kolin Klorür (139.6 mg / l) standart çözeltisi sağladı. OD Numunesi ve OD Standardı, sırasıyla LUV ve Kolin çözeltileri için 600 nm'de ölçülen absorbanslardır.
4. LUV boyutunun ve homojenliğinin karakterizasyonu
- LUV boyutunu (nm cinsinden) ve polidispersite indeksini (PdI) belirlemek için bir DLS cihazı kullanarak bir ölçüm yapın.
- Çözücünün/tamponun ve kullanılan küvetin viskozitesini belirterek uygun "standart çalışma prosedürünü" (SOP) programlayın.
- 500 μL LUV solüsyonunu polistiren yarı mikro küvete yerleştirin.
- Polistiren yarı mikro küveti bir DLS cihazına yerleştirin.
- Oda sıcaklığında, partikül dağılımının ortalama boyutu (Z-ortalaması) ve homojenlik (polidispersite indeksi, PdI) cinsinden boyut dağılımını ölçün.
- Tüm sonuçlar, her biri üç tekrarlayan döngüde gerçekleştirilen iki bağımsız ölçümden elde edilir.
NOT: LUV'ler için standart değerler, 0,149 ± 0,041 PdI ile ortalama 137 ± 7 nm olacaktır.
5. Peptit çözeltilerinin hazırlanması
- Sızıntı tahlili için analiz edilmesi gereken peptidin bir stok çözeltisini hazırlayın.
- Peptit tozunu (% >95 saflıkta) saf suda çözün (ör., 500 μL saf suda 1 mg peptit).
not: Peptitlerin saf suda seyreltilmesi ve artefaktlara neden olabilecek dimetil sülfoksit (DMSO) çözünmesinden kaçınılması önerilir (ör., membran geçirgenliği).
- Peptit çözeltisini 5 saniye boyunca girdaplayın.
- Peptit çözeltisini 5 dakika boyunca bir su sonikasyon banyosunda sonikasyon yapın ve daha sonra 12.225 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Konsantrasyon tayini için süpernatanı toplayın.
- Üç bağımsız peptit dilüsyonunun 280 nm'deki absorbansını ölçün ve ardından molar sönme katsayısı ε (peptit dizisindeki triptofan ve tirozin içeriğine bağlı olarak) ve Beer-Lambert kuralını kullanarak peptit konsantrasyonunu hesaplayın.
not: Peptit triptofan ve tirozin içeriyorsa, molar sönme katsayısı ε, Triptofan ε = 5,690 M-1 cm-1 ve Tirozin ε = 1,280 M-1 cm-1 temelinde hesaplanır. Peptit dizisi triptofan veya tirozin içermiyorsa, konsantrasyonu ölçmek için başka kolorimetrik testler yapılabilir (ör., BCA veya Bradford).
- Peptit çözeltisini saf suda 100 μM'lik nihai çözeltiye seyreltin ve 4 ° C'de saklayın.
not: Saf suda, 4 °C'lik depolama sırasında peptit bozulması meydana gelmez. Bununla birlikte, su buharlaşmasının meydana gelmediğinden emin olmak için peptit konsantrasyonu her 2 haftada bir ölçülmelidir.
6. Floresan sızıntı deneyi
- Floresan sızıntı tayini, oda sıcaklığında bir spektroflorometre üzerinde ölçülür. Uyarma ve emisyon dalga boyu sırasıyla Ex = 360 nm ± 3 nm ve Em = 530 nm ± 5 nm'de sabitlenir.
- LUV'leri 1 mL HEPES tamponu 2 içinde bir kuvars floresan küvette 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Deney sırasında çözeltiyi homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı ekleyin.
- Arka plan floresansına erişmek için ilk 100 saniye boyunca, t = 0 s ile t = 99 s arasında LUV'leri tek başına ölçün.
not: Arka plan floresansına ve potansiyel sızıntılara erişmek için tüm deney boyunca (15 dakika) tek başına LUV'ler de ölçülebilir.
- Daha sonra, sonraki 900 s (15 dakika) boyunca peptit çözeltisinin alikotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak sızıntıyı ölçün. Bu protokol, 0.1 μM ila 2.5 μM arasında test edilen her bir peptit konsantrasyonu için gerçekleştirilir.
- Son olarak, 1 μL Triton X-100 (%0.1, h/v) ilavesiyle LUV'lerin çözündürülmesiyle %100 floresan elde edildi, bu da t = 1.000 s ile t = 1.100 s arasında tamamen sönmemiş prob ile sonuçlandı.
7. Sızıntının miktarının belirlenmesi
- Test edilen her koşul için aynı sayıda noktayı korumak için t = 1.090 s'den sonra elde edilen değerleri bastırın.
- t = 0 s ile t = 49 s arasında 50 noktanın ortalamasını yaparak minimum floresan olan Fmin'i hesaplayın (yalnızca LUV'ler).
- T = 1.041 s ile t = 1.090 s (Triton X-100 ile LUV'ler) arasında 50 noktanın ortalamasını yaparak maksimum floresansı, Fmax'ı hesaplayın.
- Aşağıdaki denkleme göre her zaman noktasında (t = x) sızıntı yüzdesini (%Sızıntı) hesaplayın:
%Sızıntı(t=x) = (F(t=x) - Fdk) / (Fmaks - Fdk) x 100
- Aynı koşul için farklı LUV hazırlığı (n ≥ 2) ile elde edilen değerler için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
- Sızıntı yüzdesini, %Sızıntı(t=x), zaman (s) fonksiyonu olarak çizin.
