1. Bitki Toplama ve İşleme
- Bitki örneklerini toplayın ve işleyin
- Bitki örneklerini topladıktan sonra, bitki materyalini forseps ile sıvı nitrojene batırarak örnekleri hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın. Toplanan bitki numuneleri hızlı dondurma için çok büyükse, numuneleri kuru buz kullanarak hızlı bir şekilde soğutun ve mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. Bitki materyalinin makro besin içeriği, dokular bitkiden ayrıldıktan sonra değişebilir, bu nedenle bitki örneklerinin toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede dondurulması önemlidir.
DİKKAT: Sıvı nitrojen cilt ile temas ettiğinde ciddi donmalara neden olabilir. Lütfen sıvı nitrojeni onaylı kaplarda taşıdığınızdan ve kullanımı sırasında kriyo eldivenler, gözlükler, yüz siperi, önlük ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun KKD'leri giydiğinizden emin olun.
- Su çıkarılırken dokuların metabolik olarak inaktif olmasını sağlamak için bitki materyalini bir dondurarak kurutucu kullanarak liyofilize edin. Tüm suyun çıkarıldığından emin olmak için numunenin kütlesi stabilize olana kadar kurutun.
- Numuneler kuruduktan sonra, bir öğütücü veya değirmen kullanarak ince bir toz haline getirin. Numuneleri analize kadar kurutma kabininde saklayın.
2. Çözünür Protein Deneyi
- Numune Hazırlama
- Her bir dokunun kopya örneklerini, her biri yaklaşık 20 mg'ı 1.5 mL polistiren mikrosantrifüj tüplerine ve etiket tüplerine tartın. Bu numuneler daha sonra bilinmeyen numuneler olarak anılacaktır. Her bir numunenin tam kütlesini kaydedin, çünkü bu bilgi her bilinmeyen numunedeki %çözünür proteini hesaplamak için gerekli olacaktır. Kilitli kapakları olan mikrosantrifüj tüpleri kullanın, çünkü kilitlenmeyen kapaklar sonraki ısıtma adımı sırasında açılabilir ve bu da numune çözeltisinin kaybına neden olabilir.
- Bilinmeyen örnek proteinleri çözündürün ve izole edin
- Bir mikro pipetleyici kullanarak, her tüpe 500 μL 0,1 M NaOH ekleyin. Kapakları sıkıca kapatın ve 30 dakika boyunca sonikasyon yapın. Sıcak su banyosunu 90 °C.
önceden ısıtın
DİKKAT: Sodyum hidroksit güçlü bir bazdır ve cilt ile temasında yanıklara neden olabilir. 0,1 M NaOH düşük bir konsantrasyonu temsil etse de, cilt tahrişini önlemek için koruyucu eldiven giyin.
- Tüpleri 15 dakika boyunca sıcak su banyosunda bir rafa yerleştirin.
- Tüpleri 15.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Her numune için yeni bir pipet ucu kullanarak süpernatan sıvıyı yeni etiketli mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Pelet içeren tüpe 300 μL 0.1 M NaOH ekleyin ve 10 dakika boyunca 15.000 x g'da tekrar santrifüjleyin. Yine, süpernatan sıvıyı toplayın ve aynı numunedeki diğer süpernatan sıvı ile birleştirin. Bu potansiyel bir durma noktasıdır ve gerekirse numuneler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Bitki proteinlerini çökeltin
- 11 μL 5.8 M HCl ekleyerek süpernatan çözeltinin pH'ını nötralize edin. Her numune çözeltisine turnusol kağıdı batırarak ~7 pH'ı onaylayın.
DİKKAT: Hidroklorik asit, cilt ile temas ettiğinde (cilt uygulaması veya soluma) yanıklara neden olabilen güçlü bir aşındırıcı asittir. HCl ile çalışırken cilt tahrişini önlemek için lütfen eldiven giyin.
- Her tüpe 90 μL %100 trikloroasetik asit (TCA) ekleyin ve tüpleri 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Proteinlerin çökelmesi, çözeltiyi berraktan opak hale getirecektir. Bu 30 dakika sonra gerçekleşmezse, tüpleri 1 saat buzdolabında saklayın. Bu potansiyel bir durma noktasıdır ve gerekirse numuneler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir.
DİKKAT: Trikloroasetik asit aşındırıcıdır. Cilt ile temasını önlemek ve solumayı önlemek için lütfen tutarken eldiven giyin.
- Numuneleri 13.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. İnce bir cam mikropipet ucuna bağlı bir vakum hattı kullanarak emerek TCA süpernatantını dikkatlice çıkarın (aynı uç numuneler arasında kullanılabilir). Ağır emişten kaçınarak ve pipet ucu ile pelet arasında uygun bir mesafe bırakarak protein peletini rahatsız etmeyin.
- Peleti 100 μL -20 °C aseton ile hızlı bir şekilde yıkayın. Bu adım, sonraki Bradford tahliline müdahale edebilecek olan peletten kalan herhangi bir TCA'yı uzaklaştırır; Bununla birlikte, aseton çok uzun süre temas halinde kalırsa protein peletini çözmeye başlayacaktır, bu nedenle aseton eklenmeli ve ardından 5 saniye içinde peletten hızlı bir şekilde çıkarılmalıdır.
- Tüpleri çeker ocak veya buzdolabına yerleştirerek asetonun buharlaşmasına izin verin. Ardından, her tüpe 1 mL 0.1 M NaOH ekleyerek protein peletini çözün. Peletin tamamen çözülmesi, sıcak su banyosunda birkaç tur ısıtma, girdap ve sonikasyon gerektirebilir.
NOT: Tüpler çeker ocakta veya buzdolabında ne kadar uzun süre kalırsa ve peletler ne kadar kuru olursa, yeniden çözünmeleri o kadar zor olacaktır. Peletin 30 dakika kurutulması ve ardından asetonun buharlaştığı netleşene kadar her 10-15 dakikada bir aseton varlığının kontrol edilmesi önerilir (aseton dumanı tespit edilemez).
- Standart çözeltileri karıştırın, bilinmeyen numune çözeltilerini seyreltin ve Bradford testini kullanarak bilinmeyen numunelerin toplam protein içeriğini ölçün.
- Tablo 1'de listelenen konsantrasyonlara göre sığır immünoglobulin G (IgG) standart çözeltilerini hazırlayın (liyofilize veya IgG stok çözeltisi, her bir konsantrasyonu elde etmek için deiyonize su ile karıştırılabilir). Standartları 4 °C'de saklayın. 96 oyuklu bir plakada, kuyucuk plakasının A1 konumundan başlayarak üç nüsha halinde her bir IgG standart çözeltisinden 160 μL ekleyin (A1, A2, A3 konumunda 0 μg/μL, B1, B2, B3 pozisyonlarında 0.0125 μg/μL, vb.).
- 950 μL damıtılmış suya 50 μL 0.1 M NaOH ekleyerek seyreltilmiş bir NaOH çözeltisi hazırlayın. Boş bir negatif kontrol olarak, bu çözeltiden 60 μL'yi kuyu plakasına üçlü olarak (G1, G2, G3 konumları) ekleyin.
- Yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde 950 μL damıtılmış suya her numune çözeltisinden 50 μL ekleyerek bilinmeyen numunelerin seyreltmelerini hazırlayın. Daha sonra, her seyreltilmiş numuneden 60 μL'yi H1 konumundan başlayarak üç nüsha halinde kuyu plakasına ekleyin. 96 oyuklu bir plaka, üç kopya halinde okunduğunda 6 standart, 1 boş ve 25 bilinmeyen numunenin analizine izin vermelidir. Analiz edilen her kuyu plakası kendi IgG standardını ve boş numuneleri içermelidir.
- Tüm boş ve bilinmeyen numune kuyucuklarına 100 μL damıtılmış su ekleyin. Şimdi her kuyucuk toplam 160 μL içermelidir. Çok kanallı bir pipet (8 kanal) kullanarak, kuyucuk plakasının ilk sütunundaki her oyuğa 40 μL Coomassie parlak mavi G-250 protein boyası ekleyin. Boyayı numunelerle birkaç kez daldırarak karıştırın. Kontaminasyonu önlemek için pipet uçlarını değiştirerek diğer tüm sütunlar için tekrarlayın.
DİKKAT: Coomassie brilliant blue G-250 tahriş edicidir ve cilt, göz veya akciğerlerle temasından kaçınılmalıdır. Cilt ile temasını önlemek için lütfen eldiven giyiniz. Cilt ile teması halinde bu ürün leke tutacaktır.
- Mikroplaka spektrofotometre okumasını engelleyebileceğinden, kuyucuklarda bulunan kabarcıkları patlatmak için bir iğne kullanın. Kuyucuklar arasındaki kontaminasyonu önlemek için iğneyi temizleyin. Mikroplakanın oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmesine izin verin.
- Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak, her bir kuyucuk için absorbans değerlerini 595 nm'de kaydedin.
Tablo 1. Çözünür protein tahlili için standart eğri hesaplamaları.Her bir standarttaki protein miktarı, her bir standardın konsantrasyonunun alınması ve her bir oyuktaki standart çözelti miktarı (160 μL) ile çarpılmasıyla hesaplanır.
| IgG Konsantrasyonu (μg/μL) | Standart Numunelerdeki Protein (μg) |
| 0.0000 | 0 |
| 0,0125 | 2 |
| 0,0250 | 4 |
| 0,0375 | 6 |
| 0.0500 | 8 |
| 0.1000 | 16 |
