Bitki Dokularında Yapısal Olmayan Karbonhidratların Miktar Tayini için Kolorimetrik Test

1. Bitki Toplama ve İşleme

1. Bitki örneklerini topladıktan sonra, bitki materyalini forseps ile sıvı nitrojene batırarak örnekleri hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın. Toplanan bitki numuneleri hızlı dondurma için çok büyükse, numuneleri kuru buz kullanarak hızlı bir şekilde soğutun ve mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. Bitki materyalinin makro besin içeriği, dokular bitkiden ayrıldıktan sonra değişebilir, bu nedenle bitki örneklerinin toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede dondurulması önemlidir.
   Dikkat: Sıvı nitrojen cilt ile temas ettiğinde ciddi donmalara neden olabilir. Lütfen sıvı nitrojeni onaylı kaplarda taşıdığınızdan ve kullanımı sırasında kriyo eldivenler, gözlükler, yüz siperi, önlük ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun KKD'leri giydiğinizden emin olun.
2. Su çıkarılırken dokuların metabolik olarak inaktif olmasını sağlamak için bitki materyalini bir dondurarak kurutucu kullanarak liyofilize edin. Tüm suyun çıkarıldığından emin olmak için numunenin kütlesi stabilize olana kadar kurutun.
3. Numuneler kuruduktan sonra, bir öğütücü veya değirmen kullanarak ince bir toz haline getirin. Numuneleri analize kadar kurutma kabininde saklayın.

2. Sindirilebilir Karbonhidrat Testi

1. Numune Hazırlama
   1. Her bir dokunun kopya numunelerini, her biri yaklaşık 20 mg, kauçuk kaplı vidalı kapakları (100 mm uzunluk) olan cam 15 mL'lik tüplere tartın. Bu numuneler daha sonra bilinmeyen numuneler olarak anılacaktır. Tüpleri su geçirmez bir işaretleyici veya kapaklarda etiketleme bandı ile etiketleyin ve her bir numunenin tam kütlesini kaydedin, çünkü bu bilgi her bilinmeyen numunedeki %karbonhidratları hesaplamak için gerekli olacaktır.
2. Bilinmeyen her örnekten sindirilebilir karbonhidratları çıkarın.
   1. Her tüpe 1 mL 0.1 M H₂S4 ekleyin ve kapakları tüplere sıkıca vidalayın. 1 saat kaynar su banyosuna koyun.
      Dikkat: Sülfürik asit çok aşındırıcıdır. H_2S04'ü tutarken lütfen eldiven, gözlük ve önlük takın ve bu adımı çeker ocakta gerçekleştirin.
   2. Tüpleri ılık bir su banyosunda soğutun. Tüp içeriğini etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine dökün (cam tüplerde bazı bitki materyali kalırsa endişelenmeyin).
   3. Tüpleri 15.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatan sıvıyı bir mikro pipetleyici ile çıkarın ve yeni etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Tüpler bu noktada gece boyunca soğutulabilir. Teste devam ediyorsanız, adım 2.3.2'ye bakın.
3. Standart çözeltileri karıştırın ve bilinmeyen numunelerin toplam sindirilebilir karbonhidrat içeriğini ölçün.
   1. Tablo 1'de listelenen konsantrasyonlarla D (+) glikoz standart çözeltilerini hazırlayın. Her standart çözeltiden 400 μL içeren altı cam test tüpü hazırlayın.
   2. Bilinmeyen her numuneden 15 μL'yi kendi test tüpüne pipetleyin ve her test tüpünde toplam 400 μL hacim için her birine 385 μL damıtılmış su ekleyin. Bir çeker ocakta, her standart ve bilinmeyen numune test tüpüne 400 μL %5 fenol ekleyin ve ardından her tüpe hızlı bir şekilde 2 mL konsantre H_2S04 pipetleyin. Test tüpünün içeriğine pipet ucuyla dokunmayın, sadece çözelti yüzeyine ekleyin (bunun için en iyi tekrarlayıcı pipet işe yarar).
   3. Tüplerin 10 dakika inkübe etmesine izin verin ve ardından içeriği karıştırmak için tüpleri dikkatlice girdaplayın. 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.
      Dikkat: Fenol ve sülfürik asit aşındırıcı tahriş edicidir. Cilde, gözlere ve solumaya maruz kalmaktan korunmak için bu adım, aşağıdakileri içeren uygun KKD kullanılarak kimyasal bir çeker ocakta gerçekleştirilmelidir: yüz siperi veya göz gözlüğü, lastik eldivenler, laboratuvar önlüğü ve botlar. Fenolün sülfürik asit ile karıştırılması ayrıca ekzotermik bir reaksiyona neden olur ve bu da tüplerin ısınmasına neden olur.
   4. Her tüpten 800 μL numuneyi 3 polistiren 1,5 mL yarı mikro küvetin her birine pipetleyin (numune başına 3 teknik kopya). Spektrofotometreyi 490 nm'de okuyacak şekilde ayarlayın. Standartları veya bilinmeyen numuneleri okumadan önce ve numune okumaları boyunca aralıklı olarak damıtılmış su içeren boş bir küvete kalibre edin. Her küveti bir spektrofotometreden geçirin ve emilimini kaydedin. Bilinmeyen her örnek için teknik kopyaların ortalaması.
      not: Bazı durumlarda, numuneler üst absorbans eşiğini aşabilir. Eğer öyleyse, numuneler adım 1.3.1'de seyreltilmelidir. Seyreltmeler sonraki hesaplamalarda da hesaba katılmalıdır.
   5. Her standart için ortalama absorbansı hesaplayın.
      not: Standart eğriyi kullanarak her bilinmeyen numunede bulunan toplam sindirilebilir karbonhidrat miktarını hesaplamak için, her standardın ortalama absorbansını, her standartta bulunan D (+) glikoz mikrogramlarına karşı geriletmek en kolay yoldur, ancak istenirse her standardın D (+) glikoz konsantrasyonu (μg / μL) da çizilebilir. Bununla birlikte, aşağıdaki hesaplamalar, konsantrasyonlara (μg/μL) değil, mikrogramlara dayalı standart bir eğriye atıfta bulunur.
   6. Her standart çözeltideki toplam D (+) glikoz (μg) miktarına karşı ortalama absorbansı çizerek standart eğriyi hesaplayın. Bu verilere doğrusal bir regresyon çizgisi sığdırın ve ardından her bilinmeyen örnekteki toplam karbonhidrat miktarını (μg) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg örnekteki karbonhidrat
      A_x = bilinmeyen numunenin ortalama absorbansı
      b = y-kesişim noktası (standart regresyon çizgisi)
      m = eğim (standart regresyon çizgisi)
      Bu çizginin korelasyon katsayısı 0,98'den büyük ve rutin olarak 0,99'a yakın olmalıdır. Ardından, her bir numunedeki karbonhidrat yüzdesini belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =%karbonhidrat
      M_i = numunenin ilk kütlesi (mg)

Tablo 1. Sindirilebilir karbonhidrat tahlili için standart eğri hesaplaması. Her bir standarttaki glikoz miktarı, her bir standardın konsantrasyonunun alınması ve her bir test tüpündeki (400 μL) standart çözelti miktarı ile çarpılmasıyla hesaplanır