Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Luciferaz bazlı Toxoplasma büyüme testi
- Konakçı hücrelerin tamamen birleştiğinden emin olmak için parazit aşılamasından 1 hafta önce insan sünnet derisi fibroblastlarını (HFF'ler) tohumlayın. Parazitlerin değerlendirme süresi boyunca hücre içinde kalmasını sağlamak için şeffaf bir plakada sahte bir test yapın.
not: Burada, test 96 oyuklu mikroplakalarda gerçekleştirilir. Deneysel ihtiyaçlara göre 384 veya 1536 oyuklu mikroplakalara kadar ölçeklendirilebilir.
- Kullanımdan 2 gün önce ~ 0.3-0.4 mL tamamen parçalanmış parazitleri bir T25 şişesine aktararak Toxoplasma parazitlerini birleşik HFF'lere geçirin. Enfekte olmuş konakçı hücreleri 2 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücre içi parazitleri serbest bırakmak için 21 G'lik bir güvenlik iğnesi 5x ile 5 mL taze parçalanmış parazitleri şırınga edin, ardından konakçı hücre kalıntılarını gidermek için 3 μm'lik bir filtreden geçirin. 7 mL fenol kırmızısı içermeyen D10 ortamı kullanarak şişeden kalan parazitleri durulayın, ardından tekrar filtreden geçirin.
- Parazitleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti 10 mL fenol kırmızısı içermeyen D10 ortamında yeniden süspanse edin.
- Konsantrasyonu belirlemek için bir hemositometre kullanarak parazitleri sayın.
- Vahşi tip (WT) suş için parazitleri 1 x 104 parazit / mL'ye seyreltin. Büyüme eksikliği olan parazit suşları için, lusiferaz sinyallerinde önemli bir artış gözlemlemek için konsantrasyonu buna göre artırın.
- HFF'lerle önceden tohumlanmış 96 oyuklu mikroplakadan dikkatlice aspire edin ve 150 μL parazit resüspansiyonunu üç sütun ve beş sıra biçiminde kuyucuklara aşılayın, bu da üç teknik kopyayı ve beş zaman noktasını temsil eder.
- Mikroplakayı 37 °C'de ve %5 CO'da2 4 saat inkübe edin.
- İstila edilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için ortamı kuyulardan dikkatlice aspire edin, ardından kuyucukları her sırada (ilk sıra hariç) RT fenol kırmızısı içermeyen ortamla doldurun.
- Eşit hacimlerde PBS ve 2x lusiferaz tahlil tamponunu karıştırın ve lusiferaz substratını 12.5 μM'ye seyreltin.
- Üst sıranın her bir oyuğuna 100 μL seyreltik lusiferaz substratı ekleyin. Hücrelerin tamamen parçalanmasını sağlamak için mikroplakaları RT'de 10 dakika inkübe edin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak lusiferaz aktivitesini ölçün. Plaka okuyucu ayarları Tablo 1'de listelenmiştir. Her okuma, enfeksiyondan 4 saat sonra istilacı parazitlerin ilk sayısını temsil eder.
- Ortamı değiştirmeden 4 gün boyunca her 24 saatte bir her satır için 1.9-1.12 adımlarını tekrarlayın. Bu okumalar, enfeksiyondan 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat sonra çoğaltılan parazitlerin toplam sayısını yansıtır.
- Her bir zaman noktasındaki ortalama okumaları hesaplayın ve zaman içinde parazit büyümesindeki kıvrım değişikliklerini belirlemek için bunları 4 saatteki ortalama okumalara bölün.
- Grafik yazılımı kullanarak verileri çizin.
- İkiye katlama süresini hesaplamak için, inkübasyon süresi boyunca tek tek zaman noktalarındaki katlama değişikliklerinin log2 değerlerini çizin. Her gerinimin iki katına çıkma süresini temsil eden eğimi hesaplamak için doğrusal bir regresyon işlevi kullanın.
Tablo 1: Lusiferaz bazlı Toksoplazma büyüme testi sırasında lusiferaz aktivitesi ölçümü için mikroplaka okuyucu ayarları
kalınlığındadır
| Luciferase: | bitiş noktası |
| Entegrasyon süresi: | 1 Saniye |
| Filtre Seti - Emisyon: | Tam ışık |
| Optik: | Sayfanın Üstü |
| kazanç: | 135 |
| Okuma hızı: | normal |
| gecikme: | 100 ms |
| Okuma yüksekliği: | 4,5 mm |
