Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Toxoplasma büyümesine karşı kimyasal bileşik inhibisyon etkinliğinin değerlendirilmesi
NOT: Burada, Toxoplasma büyümesinde LHVS'nin inhibisyonunun değerlendirilmesi örnek olarak sunulmuştur. Sekiz farklı LHVS konsantrasyonu test edilmiş ve hem RHΔku80::NLuc hem de RHΔku80Δ cpl::NLuc suşları için üç biyolojik replikanın her biri için üç teknik replikasyon gerçekleştirilmiştir.
- Parazit enfeksiyonundan önce, suş başına bileşik başına bir biyolojik kopya için üç sıra ve dokuz sütun biçiminde 96 oyuklu mikroplakalara tohum HFF'leri. Konakçı hücrelerin kullanımdan önce en az 7 gün büyümesine izin verilecektir.
- Kullanmadan 2 gün önce RHΔku80::NLuc ve RHΔku80Δcpl::NLuc parazitlerini geçiriniz.
- Kullanımdan 2 gün önce ~ 0.3-0.4 mL tamamen parçalanmış parazitleri bir T25 şişesine aktararak Toxoplasma parazitlerini birleşik HFF'lere geçirin. Enfekte olmuş konakçı hücreleri 2 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücre içi parazitleri serbest bırakmak için 21 G'lik bir güvenlik iğnesi 5x ile 5 mL taze parçalanmış parazitleri şırınga edin, ardından konakçı hücre kalıntılarını gidermek için 3 μm'lik bir filtreden geçirin. 7 mL fenol kırmızısı içermeyen D10 ortamı kullanarak şişeden kalan parazitleri durulayın, ardından tekrar filtreden geçirin.
- Parazitleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti 10 mL fenol kırmızısı içermeyen D10 ortamında yeniden süspanse edin.
- Konsantrasyonu belirlemek için bir hemositometre kullanarak parazitleri sayın.
- Vahşi tip (WT) suş için parazitleri 1 x 104 parazit / mL'ye seyreltin. Büyüme eksikliği olan parazit suşları için, lusiferaz sinyallerinde önemli bir artış gözlemlemek için konsantrasyonu buna göre artırın.
- Fenol kırmızısı içermeyen ortamda parazitleri 1 x 104 parazit / mL'de yeniden süspanse edin.
- Birleşen HFF'ler içeren bir plakadan ortamı aspire edin ve her bir kuyucuğu 150 μL parazit resüsüitasyonu ile aşılayın. Mikroplakayı 37 °C'de ve %5 CO'da2 4 saat inkübe edin.
- LHVS'yi seri seyreltme ile 12 oyuklu bir rezervuarda sekiz farklı konsantrasyonda hazırlayın. Genel olarak, konsantrasyonlar seri seyreltme şeklinde üç kat azaltılır.
not: En düşük konsantrasyon, en yüksek konsantrasyona göre 6.561 kat azaltılır. Seyreltmenin kat değişimi, tek tek bileşiklerin farklı özelliklerine bağlı olarak buna göre ayarlanabilir.
- Enfeksiyondan 4 saat sonra, istila edilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için ortamı aspire edin ve her bir kuyucuğu 2-9 sütunlarından farklı konsantrasyonlarda LHVS ile desteklenmiş 150 μL ortam ile doldurun. İşlem görmeyen bir kontrol olarak hizmet etmek için ilk sütunu normal ortamla doldurulmuş olarak bırakın.
- Mikroplakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 96 saat daha inkübe edin.
- İstila edilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için ortamı kuyulardan dikkatlice aspire edin, ardından kuyucukları her sırada (ilk sıra hariç) RT fenol kırmızısı içermeyen ortamla doldurun.
- Eşit hacimlerde PBS ve 2x lusiferaz tahlil tamponunu karıştırın ve lusiferaz substratını 12.5 μM'ye seyreltin.
- Üst sıranın her bir oyuğuna 100 μL seyreltik lusiferaz substratı ekleyin. Hücrelerin tamamen parçalanmasını sağlamak için mikroplakaları RT'de 10 dakika inkübe edin.
- Tek tek kuyucukların lusiferaz aktivitesini ölçün.
- Her bir LHVS konsantrasyonunun kuyularından üç teknik kopyanın lusiferaz aktivitelerinin ortalaması.
- Normalleştirilmiş lusiferaz aktivitesini yüzde olarak hesaplamak için her bir LHVS konsantrasyonu için ortalama lusiferaz aktivitesini, tedavi edilmemiş parazitlerden türetilen ortalama lusiferaz aktivitesine bölün.
- Grafik yazılımı kullanarak normalleştirilmiş lusiferaz aktivitelerini bireysel LHVS konsantrasyonlarına göre çizin (Şekil 1). Pirimetamin'in parazit büyümesine karşı inhibisyonu da bir kontrol olarak ölçülür. Pirimetamin, Toxoplasma'da folik asit metabolizmasını inhibe ederek akut toksoplazmozu tedavi etmek için kullanılan klinik bir antibiyotiktir.
- "Doz-yanıt-inhibisyon" regresyon programı altında, grafik yazılımındaki gömülü yöntemi, normalleştirilmiş yanıta karşı [inhibitör] kullanarak tek tek bileşikler için IC50 değerlerini hesaplayın. IC50, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Nerede: Y, farklı inhibitör konsantrasyonları altında enfekte olmuş hücrelerin normalleştirilmiş lusiferaz aktivitelerini temsil eder ve X, bireysel inhibitör konsantrasyonlarını temsil eder.
