1. Lipozom Hazırlama
- Dış mitokondriyal zarı taklit etmek için kloroform lipit stoklarını uygun oranlarda birleştirin.
- 25 mg lipit karışımı hazırlayın. 48:28:10:10:4 molar oranda tavuk yumurtası fosfatidilkolin (PC), tavuk yumurtası fosfatidil etanolamin (PE), sığır karaciğeri fosfatidil inositol (PI), sentetik 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (DOPS) ve sentetik 1',3'-bis [1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo]-gliserol (TOCL). Örnek hesaplamalar Tablo 1'de gösterilmiştir.
- Yoğuşmayı sınırlayacağı için açmadan önce tüm lipit stoklarını oda sıcaklığına getirin. Çoğu laboratuvar, lipitlerin konsantrasyonunu ölçmek için kesin bir yola sahip olmadığından, kloroform stoğu tarafından emilen herhangi bir su, lipit stoğunun konsantrasyonunu ve dolayısıyla tahlilde kullanılan lipitlerin oranını değiştirecektir.
- Lipid stokları cam ampullerde geldiğinden, gerekli miktarda lipiti 1 mL'lik bir şırınga kullanarak bir cam şişeye aktarın. Lipid oksidasyonunu önlemek için şişeye 2 mg ditiyotreitol (DTT) ekleyin. Kloroformun buharlaşması lipit konsantrasyonunu değiştireceğinden hızlı çalışın.
- Kalan herhangi bir lipiti ayrı bir cam şişeye aktarın ve bir PFTE septa ile yerleştirin. Şişeye 2 mg DTT ekleyin, parafilm ile sarın ve lipid oksidasyonunu önlemek için -20 ° C'de saklayın. Lipitleri şişelere aktarıldıktan sonraki 3 ay içinde kullanmaya çalışın. Kloroform stoklarının işaretleyici akışı ile olası kontaminasyonunu önlemek için, etiketleri orijinal ampullerden işaretleyici ile etiketlemek yerine cam şişelere aktarın.
- Cam şişeyi bir çeker ocakta sürekli olarak elle döndürürken kloroformu çok yumuşak bir nitrojen akışı altında buharlaştırın, esasen manuel bir rotovap görevi görür. Lipitlerin hareket etmesini sağlamak için şişeyi elle tutarlı bir hızda (20-40 rpm) döndürün. Amaç, tüm kloroformu buharlaştırmak ve tüm cam şişe üzerinde eşit bir lipit tabakası elde etmektir.
Dikkat: Kloroform nörotoksiktir ve bu adım çeker ocakta yapılmalıdır.
- Nitrojen tüpüne yeni bir Pasteur pipeti takın. Lipitlerin hiçbirinin flakondan veya Pasteur pipetinin üzerine sıçramasına izin vermeyin. Ucu şişenin altına doğrultun, böylece hava alttan sıçrar ve lipitleri şişenin merkezine doğru iter. Köşelerde veya kapakta herhangi bir birikmeyi önlerken tüm şişenin üzerinde eşit bir kaplama elde edin. Tüm bu işlem yaklaşık 5 dakika sürer.
- Karışım bir lipit "boncuğuna" kalınlaştıkça, şişenin açısını değiştirerek şişenin merkezine doğru yönlendirin. Boncuk küçülmeye başladığında, boncuğu dağıtmak için nitrojen akışını hafifçe yukarı çevirin ve lipitlerin hiçbirinin şişeden dışarı çıkmadığından emin olun.
- Kalan kloroformu vakum altında çıkarın.
- Artık kloroformun çoğunu çıkarmak için cam şişeyi 1 saat boyunca bir ev tipi vakum veya diyaframlı vakum pompasına koyun. Bu vakumlar genellikle kloroformun tamamını uzaklaştıracak kadar güçlü değildir, ancak az miktarda çözücüyü döner vain vakumlardan daha iyi tolere edebilirler.
- Tüm kalıntı kloroformu çıkarmak için şişeyi 12-16 saat boyunca güçlü bir vakuma (<1 mTorr) koyun. Bu işlem sırasında şişenin çarpmasını önlediğinizden emin olun.
- Lipitleri 1.25 mL lipozom tamponunda (50 mM HEPES KOH pH 7.5,% 15 gliserol, 1 mM DTT) yeniden süspanse edin. 25 mg lipit ile başladığımız için, bu 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonla sonuçlanır. Lipitleri görünür parçalar olmadan tamamen yeniden süspanse edin. Lipitler şişenin köşesinde toplanırsa, bu uzun bir süreç olabilir.
- Numune süt kıvamında pürüzsüz olana kadar şişeyi kuvvetlice vorteksleyin. Kloroform buharlaştırma işlemi bir gece önce düzgün bir şekilde yapıldıysa, bu işlemin yaklaşık 5-10 dakika sürdüğünü bulduk.
- Lipitlerin tamamen yeniden süspansiyonunu sağlamak için, oda sıcaklığında bir tekerlek üzerinde ~ 80 rpm'de 3 saat döndürün. Eşit karıştırmayı sağlamak için 1 dakikalık girdap için şişeyi saatte bir tekerlekten çıkarın.
- Lipitleri dikkatlice 1.5 mL'lik temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Dondurmak için sıvı nitrojen ve çözmek için 5 °C'lik bir ısı bloğu kullanarak 30 donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin. Bu adım, çok katmanlı vezikülleri unilamellar veziküllere dönüştürmeye yardımcı olur.
- Lipitleri ekstrüde edin.
- Donma-çözülme döngüleri sırasında mini ekstrüderi hazırlayın. Mini ekstrüderi 10 mm filtre destekleri ve istenen gözenek boyutunda bir polikarbonat membran ile birleştirin (200 nm kullanıyoruz). Filtrenin boyutu, lipozomun boyutunu etkileyecek ve bu da sulandırma için gerekli protein konsantrasyonunu etkileyecektir (Adım 2.3).
- Mini ekstrüderi sıcak bir plakaya yerleştirin ve ekstrüder sıcaklığını 60 °C'ye getirin.
- Lipitleri 1 mL gaz geçirmez bir cam şırıngaya çekin ve mini ekstrüderin bir ucuna dikkatlice yerleştirin. Boş gaz geçirmez şırıngayı mini ekstrüderin diğer tarafına yerleştirin. Lipitlerin 5-10 dakika boyunca ekstrüder stand sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
- Doldurulmuş şırınganın pistonunu hafifçe iterek lipitleri alternatif şırıngaya aktarın. Çözeltiyi alternatif şırıngadan orijinal şırıngaya itin. Bu ileri geri işlemi 15 kez tekrarlayın, böylece 15. geçişte lipitler alternatif şırıngada sona erer. Sızıntı olmadığından emin olmak için her geçişte ses seviyesini izleyin.
- Lipitlerin tek kullanımlık alikotlarını hazırlayın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve -80 ° C'de saklayın. Lipozomlar birkaç ay boyunca -80 ° C'de stabildir. Sulandırmalar bir seferde 10 μL lipozom gerektirir (Adım 2.3.4), bu nedenle 10 μL veya 20 μL alikot hazırlamak uygundur.
2. Msp1 ve Model TA proteininin sulandırılması
- Sulandırma tamponunu hazırlayın: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM potasyum asetat, 7 mM magnezyum asetat, 2 mM DTT, sakaroz, %0.01 sodyum azid, %0.2-0.8 Deoxy Big Chaps (DBC).
- Yeni lipozom grubu için sulandırma koşullarını optimize edin. Optimal sulandırma için gerekli DBC ve biyoboncukların konsantrasyonu, kullanılan lipozom grubuna bağlı olarak değişir. Hazırlıktan hazırlığa değişkenliği sınırlamak için, tüm denemeler için aynı DBC lotunu kullanın. Çok sayıda DBC'yi değiştirirken, optimizasyon işlemini tekrarlayın.
- Her yeni lipozom partisi hazırlandığında farklı konsantrasyonlarda DBC (% 0.2 -% 0.8) ve biyoboncuklar (25 mg - 100 mg) içeren bir dizi sulandırma oluşturun. DBC'yi ~% 0.12'lik kritik misel konsantrasyonunun (CMC) altına düşürmemek önemlidir. Koşullar optimize edildikten sonra, tüm verileri aynı lipozom hazırlama ve sulandırma koşullarını kullanarak toplamanızı öneririz.
- Adım 3'te açıklanan ekstraksiyon testini kullanarak çeşitli sulandırma koşullarının etkinliğini test edin.
- Biyoboncukları 250 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda hazırlayın.
- 2,7 g kurutulmuş biyoboncukları tartın ve boncukları ıslatmak için 0 metanol (yaklaşık 45 mL) içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde yeniden süspanse edin. Boncukların gözeneklerinde havanın sıkışmasını önlemek için başlangıçta biyoboncukları metanolde ıslatın. Metanole girdikten sonra, biyoboncuklar tarafından hapsedilen herhangi bir hava deterjanı emme yeteneklerini değiştireceğinden, biyoboncukları ıslak tutun.
- Boncukları 8x yaklaşık 45 mL ultra saf su (18.2 mΩ) ile yıkayarak metanolü çıkarın, bundan sonra ddH2O olarak anılacaktır. Pelet boncukları 1 dakika boyunca 3.200 x g'da döndürerek. Sıvıyı boşaltın ve ddH2O'da yeniden süspanse edin.
- Yıkadıktan sonra,% 0.02 sodyum azid ile 10 ml ddH2O içinde tekrar süspanse edin ve 4 ° C'de saklayın. Biyoboncuklar birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bu stok 250 mg / mL'dir, çünkü yıkama adımları sırasında ~ 0.2 g kaybolduğu varsayılmaktadır.
- Lipozomun boyutunu ve lipozom başına istenen TA proteini ve Msp1 molekülü sayısını hesaplayın. Bu, sulandırma için gerekli olan Msp1 ve TA proteininin konsantrasyonunu belirleyecektir.
- İlk olarak, denklemi kullanarak unilamellar lipozom başına lipid moleküllerinin sayısını (Ntoplam) hesaplayın
burada d lipozomun çapı, h çift tabakanın kalınlığı ve a lipid baş grubu alanıdır.
- Lipozom çapını DLS ile ölçün. Örneğimizde, lipozom çapı (d) için 70 nm'lik bir değer elde edilmiştir.
- Fosfatidilkolin için kafa grubu boyutu olan h için 5 nm ve a için 0,71 nm2 değerini kullanın. Bu özel durumda, Ntoplam 37.610'dur.
- Daha sonra, karışımdaki lipitlerin ortalama moleküler ağırlığını kullanarak lipid MLipid'in molar konsantrasyonunu hesaplayın. Bu örnekte, lipitlerin konsantrasyonu 20 mg/mL'dir (Adım 1.4) ve lipitlerin ortalama moleküler ağırlığı 810 g/mol'dür (Tablo 1). Bu, MLipid için 0.0247 M değeriyle sonuçlanır.
- Ardından, denklemi kullanarak lipozomların molar konsantrasyonunu hesaplayın, MLipozom,
burada MLipid, Adım 2.3.2'deki molar lipid konsantrasyonudur ve Ntoplamı, Adım 2.3.1'de hesaplanan lipozom başına toplam lipid sayısıdır. Bu örnekte, lipozomların 20 mg / mL stok konsantrasyonu yaklaşık 660 nM'dir.
- 100 μL'lik bir sulandırma reaksiyonu için gereken Msp1 ve TA proteini miktarını hesaplayın.
not: Sulandırmadaki nihai lipit konsantrasyonu 2 mg / mL'dir, bu da lipozom stoğunun 10 katı seyreltilmesidir. Bu, 66 nM'lik bir son lipozom konsantrasyonu verir. Msp1'in nihai konsantrasyonu 792 nM'dir, bu da lipozom başına ortalama 12 toplam kopya (2 fonksiyonel heksamer) verir. TA proteininin nihai konsantrasyonu 660 nM'dir ve bu da lipozom başına ortalama 10 kopya verir.
- Bir PCR tüpünde, saflaştırılmış Msp1, TA proteini ve lipozomları sulandırma tamponunda karıştırın. Ekleme sırası tampon, proteinler ve lipozomlar en sondur. Toplam hacim 100 μL'dir. Karışımın 10 dakika buz üzerinde oturmasına izin verin. Msp1 ve TA proteinini saflaştırın.
- Testi ilk oluştururken pozitif bir kontrol substratı olarak iyi karakterize edilmiş model TA proteini His-Flag-Sumo-Sec22'yi kullanın. Bu yapı, kolay saflaştırma için bir His-etiketine, western blot tarafından tespit için 3x-Flag etiketine, daha fazla çözünürlük için bir Sumo alanına ve Msp1 tarafından sulandırılması ve tanınması için ER-TA proteini Sec22'nin TMD'sine sahiptir.
- Protein saflaştırmasından elde edilen N-Dodesil β-D-maltositin (DDM) sulandırma üzerindeki etkisini en aza indirmek için hem Msp1 hem de TA proteininin stok çözeltilerinin yaklaşık 100 μM olduğundan emin olun. Saflaştırılmış Msp1, 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM sodyum klorür, 0.1 mM Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP), %0.05 DDM iken, saflaştırılmış TA proteini 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodyum klorür, 10 mM magnezyum klorür, 5 mM β-merkaptoetanol, gliserol, %0.1 DDM'dir. Yaklaşık 100 μM TA proteini ve Msp1 monomerinden oluşan stok çözeltileri, bu bileşenlerin nihai sulandırma hacminin < %5'ini oluşturmasını sağlar ve bu da CMC'nin altında bir DDM seyreltmesi ile sonuçlanır.
- Deterjanı çıkarmak için numuneye istenen miktarda biyoboncuk ekleyin.
- Bir p200 pipet ucunun ucunu, boncukların uçtan sığabilmesi için yaklaşık 1/8inç çapında kesin. Homojen bir karışım elde etmek için biyoboncuk tüpünü iyice girdaplayın ve biyoboncuklar çökmeden önce kapağı hızla çıkarın ve hacmi pipetleyin. Biyoboncukları boş bir PCR tüpüne aktarın.
- Sulandırma buz üzerinde 10 dakikalık inkübasyonunu bitirdiğinde, biyoboncuklardan tüm sıvıyı çıkarmak için kesilmemiş bir pipet ucu kullanın. Daha sonra 100 μL'lik sulandırmayı biyoboncuklarla birlikte tüpe aktarın. Bu, biyoboncukların havayı hapsetmemesi ve boncukların yüzmesine neden olması için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
- Sulandırmanın 80 °C'de 16 saat boyunca ~4 rpm'de bir tekerlek üzerinde dönmesine izin verin.
- Sulandırılmış materyali biyoboncuklardan çıkarın. Biyoboncukları peletlemek için bir picofuge'da hızlı bir dönüş yapın ve ardından sulandırılmış materyali temiz bir PCR tüpüne aktarmak için kesilmemiş bir pipet ucu kullanın. Numunede hiç biyoboncuk kalmayana kadar bu işlemi 1-2 kez tekrarlayın. Sulandırmayı buz üzerinde tutun.
- Lipozomlara yeniden sulandırılamayan proteinleri çıkarmak için sulandırılmış materyali önceden temizleyin.
- Ekstraksiyon Tamponu Hazırlayın: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM potasyum asetat, 7 mM magnezyum asetat, 2 mM DTT, 100 nM kalsiyum klorür.
- Glutatyon spin kolonlarını üreticinin talimatlarına göre Ekstraksiyon Tamponu ile dengeleyin. Bu tipik olarak 400 μL tampon ile 3 tur yıkamayı ve ardından tamponu çıkarmak için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjlemeyi içerir.
- Sulandırılmış malzemeye her bir şaperondan (GST-SGTA ve GST-Calmodulin) 5 μM ekleyin. Bu şaperonlar, lipozomlara yeniden oluşturulamayan herhangi bir proteinin TMD'sine bağlanacaktır. Şaperonların saflaştırılması daha önce tarif edilmişti.
not: Bu şaperonlar ticari olarak temin edilebilir, ancak maliyet ve kaliteyi kontrol etmek için şirket içinde saflaştırmayı tercih ediyoruz. Her iki protein de 20 mM Tris pH 7.5, 100 mM sodyum klorür ve 0.1 mM TCEP'dedir ve 160 μM civarında bir stok konsantrasyonuna sahiptir. SGTA, yüksek derecede hidrofobik bir TMD'ye sahip substratları tanırken, Calmodulin, TMD'leri orta derecede hidrofobiklik ile bağlar. Birlikte, bu şaperon kokteyli çok çeşitli alt tabakaları tanıyabilir.
- Sulandırılmış malzemeye 100 μL ekstraksiyon tamponu ekleyin ve hacmi 200 μL'ye çıkarın. Bunu dengelenmiş glutatyon spin kolonlarına ekleyin. Glutatyon spin kolonlarının, ön temizleme hacmi 200 – 400 μL olduğunda en yüksek numune geri kazanımını sağladığını unutmayın.
- Döndürme kolonlarını takın ve şaperonların reçineye bağlanmasına izin vermek için 80 ° C'de 4 rpm'de 30 dakika döndürün.
- Sütunları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 700 x g'da döndürün. İçinden geçen akış, toplanmış proteinlerden tükenmiş önceden temizlenmiş malzemedir. Malzemeyi buz üzerinde tutun ve doğrudan ekstraksiyon tahlili ile devam edin.
3. Ekstraksiyon Testi
- SDS PAGE analizi için tüpleri hazırlayın. Her reaksiyonun 4 tüpü olacaktır: GİRİŞ (I), AKIŞ (FT), YIKAMA (W) ve ELUTE (E).
- GİRİŞ tüpüne 45 μL ddH2O numunesi, FLOW THROUGH tüpüne 40 μL ddH2O ve YIKAMA ve ELUTE tüplerine 0 μL ekleyin.
not: Bu tahlildeki en iyi sinyal-gürültü oranı, WASH ve ELUTE numuneleri, INPUT ve FLOW THROUGH numunelerine göre 5x konsantre olduğunda elde edilir. Tahlil sırasındaki seyreltmeler nedeniyle, bunun için INPUT numunesi için 5 μL NUMUNE, FLOW THROUGH numunesi için 10 μL numune ve WASH ve ELUTE numuneleri için 50 μL numune alınması gerekir.
- Her tüpe 16,6 μL 4x SDS PAGE Yükleme Tamponu ekleyin. SDS PAGE Yükleme Tamponundan önce her bir numunenin toplam hacmi 50 μL'dir. Nihai hacim 66,6 μL'dir (50 μL numune + 16,6 μL 4x SDS PAGE Yükleme Tamponu).
- Ekstraksiyon tahlilini birleştirin.
- 60 μL önceden temizlenmiş proteolipozom, 5 μM GST-SGTA, 5 μM GST-Kalmodulin ve 2 mM ATP içeren ekstraksiyon reaksiyonunu hazırlayın. Reaksiyonu başlatmak için kullanılan ATP dışındaki tüm reaktifleri birleştirin. Ekstraksiyon Tamponu ile 200 μL'lik son hacme getirin.
not: Her ekstraksiyon testi için 60 μL numune kullanıldığından, üç farklı ekstraksiyon testi için bir sulandırma kullanılabilir. Aynı sulandırmadan elde edilen malzeme üzerinde pozitif ve negatif kontroller (+ATP ve -ATP) gerçekleştirin.
- 30 °C ısı bloğunda 2 dakika önceden ısıtılmış ekstraksiyon testi.
- 2 mM'lik son konsantrasyona ATP ekleyerek ekstraksiyon testini başlatın ve zamanlayıcıyı başlatın.
- ATP'yi reaksiyona karıştırmak için bir picofuge içinde 5 saniyelik bir dönüş yapın. Reaksiyonu 30 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, reaksiyonun 5 μL'sini alın ve INPUT tüpüne ekleyin. Bunun zamanlaması esnektir.
- Bu inkübasyon süresi boyunca, ekstraksiyon testindeki her numune için bir glutatyon spin kolonunu dengeleyin.
- Çıkarılan materyali izole etmek için refakatçiler üzerinde aşağı çekme işlemi gerçekleştirin.
- 30 dakikalık inkübasyon bittiğinde, toplam hacmi 400 μL'ye getirmek için tüpe 200 μl ekstraksiyon tamponu ekleyin. Dengelenmiş glutatyon reçinesine ekleyin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de tekerleğe bağlanmasına izin verin.
- Akışı toplamak için sütunları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 700 x g'da döndürün. FLOW THROUGH tüpü için 10 μL alın. Bu numune, hala lipid çift tabakasına entegre edilmiş substratları içerir.
- Reçineyi 400 μL ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın ve akışı boşaltın. Üçüncü yıkamada, akışı devam ettirin ve YIKAMA tüpü için 50 μL alın.
- Ekstraksiyon Tamponunda 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona indirgenmiş glutatyon ekleyerek 5 mL Elüsyon Tamponu hazırlayın. Bu tamponu her seferinde taze olarak hazırlayın.
- Döndürme kolonuna 200 μL Elüsyon Tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Elute etmek için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 700 x g'da döndürün. Akışı devam ettirin. Toplam elüsyon hacmi 400 μL olacak şekilde işlemi ikinci kez tekrarlayın.
- Elution örneğinden 50 μL örnek alın ve ELUTE tüpüne ekleyin.
adet
adet
25 mg'da
| Lipid | Köstebek % | Mw | Ort. MW | 25 mg içinde μmol | 25 mg içinde mg | Klor stoğu (mg/mL) | 25 mg için μL |
| kişisel bilgisayar | H | 770 | 369,6 | 14,82 | Saat 11.41 | 25 | 456,4 |
| Pe | ( | 746 | 208,88 | 8,64 | 6,45 | 25 | 258,0 |
| pi | | 902 | 90,2 | 3,09 | 2,78 | 10 | 278,5 |
| Görüntü Yönetmenliği | | 810 | 81 | 3,09 | 2,50 | 10 | 250,1 |
| İçindekiler | %4 | 1502 | 60,08 | 1,23 | 1,85 | 25 | 74,2 |
| Conc. Corr Ort. MW | 809.76 |
| μmol | 30.87 |
Tablo 1: Lipozom hazırlığı için örnek hesaplamalar. Bu tablonun temel amaçları, lipid karışımının konsantrasyonu düzeltilmiş ortalama moleküler ağırlığını ve lipozomları yapmak için gereken her bir lipit stoğunun hacmini hesaplamaktır. MW ve stok konsantrasyonu ürün etiketlerinden gelir. Lipitler ve mol % kullanıcı tarafından seçilir.
