Parazitlerde İlaca Bağlı Sitotoksisiteyi Değerlendirmek için β-Galaktosidaz Testi

Özet

Kaynak: Alonso, V. L. et al. İn vitro β-galaktosidaz eksprese eden parazitler kullanılarak Trypanosoma cruzi'nin tüm yaşam döngüsü aşamalarına karşı ilaç taraması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, β-galaktosidaz enzimini eksprese eden bir parazit olan Trypanosoma cruzi'ye karşı tripanosidal bir ilacın sitotoksik potansiyelini belirlemek için basit ve sağlam bir yöntemi açıklıyoruz. β-galaktosidaz bir hücre lizis göstergesi olarak hizmet eder ve aktivitesi ilacın etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Protokol

>1. β-galaktosidaz testi

>NOT: β-galaktosidaz aktivitesinin kantitasyonu, parazitlerin sayısını belirlemenin dolaylı bir yolu olarak kullanılır. Tripanosidal bir bileşiğin varlığında büyümenin inhibe edilmesi, tedavi edilmemiş kontrole kıyasla daha az sayıda parazite yol açması beklenmektedir, bu da daha düşük bir β-galaktosidaz aktivitesine ve dolayısıyla daha düşük absorbansa yansıyacaktır.

1. Parazitleri BZN ile inkübe edin
   1. 80, 40, 20, 10, 5 ve 2.5 μM ila 100 μL epimastigot süspansiyonu, amastigotlu Vero hücreleri (enfeksiyondan 2 gün sonra) veya 96 oyuklu bir plakada tripomastigotlar nihai BZN konsantrasyonuna ulaşmak için kuyu başına 100 μL karşılık gelen 2x benznidazol (BZN) çözeltisi ekleyin.
   2. Epimastigotları 28 ° C'de 72 saat inkübe edin ve tripomastigotları veya enfekte Vero hücrelerini 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO₂.
      not: Her ilaç konsantrasyonu en az üç kopya halinde değerlendirilmeli ve epimastigotların, tripomastigotların ve dimetilsülfoksit (DMSO) ile enfekte olmuş Vero hücrelerinin kontrol kültürlerini içermelidir.
2. Kolorimetrik reaksiyon
   1. Tedavi inkübasyon süresinden sonra, enfekte Vero hücreleri veya tripomastigotlar Dulbecco'nun fenol kırmızısı ile Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) ise, paraziti önlemek için ortamı 100 μL 1x PBS ile değiştirin. Yalnızca 100 μL karşılık gelen ortam (veya uygun şekilde 1x PBS) içeren üçlü boş kuyular gerçekleştirin.
      not: Fenol kırmızısı içermeyen LIT ortamı veya DMEM durumunda epimastigotlar için kültür ortamının çıkarılması gerekli değildir. Fenol kırmızısı ile DMEM hala kullanılabilir; Baz absorbansını ölçmek için tek başına DMEM ile boş bir kuyu hazırlayın ve ardından veri analizi sırasında bu değeri çıkarın. Schneider'in renksiz olan böcek ortamı, epimastigotlar için bir alternatiftir.
   2. Her bir oyukta 40 μL klorofenol kırmızı β-D-galaktopiranosid (CPRG) substrat çözeltisi ve 10 μL deterjan çözeltisi ekleyin, her bir kuyucukta 250 μL'lik bir nihai hacimde 200 μM CPRG ve %0.1 deterjan konsantrasyonu elde edin.
      not: CPRG çözeltisi ve deterjan, kuyucuk başına 50 μL'lik bir nihai hacimde birlikte eklenebilir.
   3. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin ve bir mikroplaka spektrofotometresinde 595 nm'de absorbansı ölçün.
      not: Beklenen renk değişimi, β-galaktosidaz enzimatik bölünmesi üzerine sarı ila kırmızımsı kahverengidir (Şekil 1A). Kuluçka süresi 4 saate kadar uzatılabilir ve klorofenol kırmızısının absorbans spektrumları, benzer eğri uydurma ile 570 ila 595 nm arasında okunabilir. CPRG substratının varlığında 24 saate kadar inkübasyon, benzer eğri bağlantı parçaları göstermiştir.

Sonuçlar

Şekil 1: Dm28c epimastigot formu için benznidazolün IC50 değerinin hesaplanması. (A) CPRG (1) eklenmeden önce farklı BZN konsantrasyonları (2.5, 5, 10, 20, 40 ve 80 μM) ile muamele edilmiş epimastigotlu 96 oyuklu bir plaka, ilk CPRG ve deterjan ilavesinden sonra (2) ve CPRG ve deterjan ile inkübattan sonra renk değişikliğini gösteren (3). (B) Dm28c / pLacZ epimastigot...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 oyuklu plakalar	Corning	3599
benznidazol	Sigma Aldrich	419656
5 mL serolojik pipet steril	Jet Biyofil	GSP010005
10 mL serolojik pipet steril	Jet Biyofil	GSP211010
Biyogüvenlik Kabini	Telstar	Biyo II Klima
Hızlı Solunum Cihazı (CPRG)	Roche	10 884308001	Klorofenol Kırmızı-β-D-galaktopiranosid
DMEM, Yüksek Glikoz	Termo Balıkçı Bilimi	12100046	toz
DMSO (Türkçe)	Sintorgan Belediyesi	SİN-061	Dimetilsülfoksit
Fetal Baldır Serumu	Internegocios SA	FCS FRA 500	Steril ve ısıyla inaktive edilmiş
Vero hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1587
Mikroplaka Spektrofotometresi	Biyotek	Sinerji HTX
Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mL	Katran	500010-N
G418 disülfat tuzu çözeltisi	Roche	G418-RO	Stok konsantrasyonu: 50 mg/mL

adet · Serisi Serisi