Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Beyin dilimlerinden veya yumruklarından ex-vivo endojen monoamin salınımı
>NOT: Bu bölüm için kullanılan cihaz, 48 oyuklu bir plaka ve bir karbojen hattına bağlı iç filtreler olmadan altı mikrosantrifüj filtre ünitesinden yapılmış bir doku tutucudan oluşur (Şekil 1). Tutucuyu yapmak için sağlam bir plastik çubuk kullanın (örneğin, bir hücre sıyırıcıdan) ve mikrosantrifüj filtre ünitelerini iç filtreler olmadan süper yapıştırın. 1-2 gün kurumaya bırakın. Endojen monoamin salınım deneyi için gereken süre ve amfetamin, fluoksetin ve kokain konsantrasyonları mevcut literatüre ve önceki protokollere dayanmaktadır.
- Doku aktivasyonu
- Beyin dokusunu akış odasının her bir oyuğuna aktarın ve sabit, hafif köpürme ile 0.5-1 mL oksijenli akış tamponunda bir slayt ısıtıcısında 37 ° C'de 30-50 dakika iyileşmeye izin verin (Şekil 1B1).
- Bu inkübasyon sırasında, ilaçları deney için istenen konsantrasyona seyreltin. Tüm ilaçlar akış tamponunda çözülmelidir ve konsantrasyonlar mevcut literatüre dayanmaktadır.
- İlk kuluçka
- Beyin dokusu olan doku tutucuyu 500 μL oksijenli akış tamponu içeren kuyucuklara taşıyın ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. Tutucuda fazla tampon kalmayana kadar tutucuyu kuyunun kenarına vurarak minimum veya hiç tampon taşınmadığından emin olun.
- Monoamin taşıyıcı inhibitörler gibi farmakolojik ajanlarla yapılan deneylerde, doku örneklerini oksijenli akış tamponunda seyreltilmiş ilaçlarla inkübe edin (örneğin, 10 μM Fluoksetin, 40 μM kokain; bkz. Şekil 1B2). Her kuyucuğun son hacmi 500 μL olacaktır.
- İkinci kuluçka
- Tutucuyu doku ile birlikte, her ilacın istenen konsantrasyonu olsun veya olmasın 500 μL toplam akış tamponu içeren yeni bir kuyucuk setine taşıyın. Fazla arabellek kalmadığından emin olun. Her kuyucuk, deney koşulları için bir n= 1'i temsil eder. Her deney koşulu üç nüsha halinde gerçekleştirilir.
- Bir kuyucuk oksijenli bir akış tamponu, sonraki 10-30 μM AMPH ve son kuyu 10-30 μM AMPH artı monoamin taşıyıcı inhibitörleri içerir. Her ilaç oksijenli akış tamponu içinde çözülür.
- Dokuyu 500 μL ilaç koşulu ile 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
not: Ek kuyucuklar, monoamin taşıyıcı inhibitörleri olan veya olmayan oksijenli yüksek K + akış tamponu içerebilir. Her ilacı oksijenli akış tamponunda (500 μL) çözün.
- 20 dakikalık bu ikinci inkübasyon sırasında, adım 1.2.1'deki ilk inkübasyondan çözeltiyi kuyucuklardan toplayın ve 50 μL 1 N perklorik asit veya fosforik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın (HPLC tipine bağlı olarak, nihai konsantrasyon 0.1 N). Numunenin nihai hacmi 550 μL olacaktır. Mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde tutun ve tüpleri #1 olarak etiketleyin.
- 20 dakikalık ikinci inkübasyondan sonra, doku tutucuyu beyin bölümleri veya zımbalarla boş bir kuyuya taşıyın ve plakayı buz üzerinde tutun. Süpernatanı 50 μL 1 N perklorik asit veya fosforik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numunenin nihai hacmi 550 μL olacaktır. Mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde tutun ve tüpleri #2 olarak etiketleyin.
- Her kuyucuk içeren dokuya 1 mL buz gibi soğuk diseksiyon tamponu ekleyin. Küçük cımbız kullanarak tüm dokuyu toplayın ve temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Beyin dokusu olan tüpleri -80 ° C'de tutun. 1 mL diseksiyon tamponunu atın (Şekil 1B4).
- 2.500 x g'da 2 dakika boyunca mikrosantrifüj filtre tüpleri (0.22 μm) kullanılarak her inkübasyondan elde edilen filtre çözeltileri. Elektrokimyasal algılamalı HPLC kullanarak monoamin içeriğini belirlemek için süzüntüyü kullanın (Şekil 1B5).
