Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Mount Sinai kurumsal çekirdek ve kullanım komitesindeki Icahn Tıp Okulu tarafından onaylanmıştır.
1. Yetişkin farelerden valf hücresi izolasyonu öncesi hazırlık
- Şekil 1A'da gösterilen tüm cerrahi aletleri %70 v/v etanol kullanarak ve ardından 30 dakika otoklavlayarak temizleyin ve sterilize edin. Cerrahi çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin.
- 50 mL 10 mm HEPES'e 500 μL penisilin-streptomisin ekleyin. 50 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) alikotu hazırlayın. Çözeltileri buz üzerinde tutun.
- 1 mg / mL ve 4.5 mg / mL kollajenaz çözeltileri hazırlayın ve tüm prosedürü gerçekleştirmek için 15 mL'lik tüplerde her çözeltiden 5 mL kullanın. 5 mL 1 mg / mL kollajenaz hazırlamak için, 5 mg kollajenazı 2.5 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM, fetal sığır serumu (FBS) içermez) ve antibiyotiklerle desteklenmiş 2.5 mL 10 mM HEPES (adım 1.2'den %1 penisilin-streptomisin) ile karıştırın. Herhangi bir kontaminasyonu gidermek için çözeltileri 0,22 μm'lik bir filtreden filtreleyin.
NOT: Enzimleri korumak için çözeltileri buz üzerinde tutun.
- Aşağıda açıklanan tüm adımlarda kullanmadan önce DMEM solüsyonunu 37 °C'ye ısıtın. DMEM'i %1 penisilin-streptomisin, %1 sodyum piruvat, 5 mL 200 mM L-glutamin, 1 mL mikoplazma eliminasyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve %10 FBS ile takviye ederek tam ortam hazırlayın.
2. Valf hücrelerinin izolasyonu
- Deney için 105 hücre elde etmek için, 8 haftalık beş fare (en az üç) kullanın. Fareyi, 1 mL izofluran ile ıslatılmış küçük bir kağıt mendil parçasıyla birlikte bir indüksiyon odasına yerleştirin, ancak doku ile temasına izin vermeyin. Hayvanın tamamen uyuşturulduğunu doğrulamak için; Ayak parmağı kıstırma refleksini kontrol edin ve ardından fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın. Aşağıda açıklanan prosedür terminal olduğundan, servikal çıkıktan önce herhangi bir ağrıyı hafifletmek için izofluran kullanın.
- Fareyi bir diseksiyon platformuna yerleştirin ve yerinde tutmak için pençeleri kanüllerle sabitleyin. Göğsü ve karnı etanol ile temizleyin; Karnı ve göğsü makasla açın. Küçük bir cerrahi makasla, fareyi kan kaybına uğratmak için sol atriyum ile sol ventrikül arasında kesin. Kalpteki kanı almak için kalbi 10 mL soğuk 1x PBS ile perfüze edin.
- Kalbi kesin ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi çıkan aorttan 3 mm uzakta tutun. Aort kapağını stereomikroskop altında inceleyin. Kalbi ventriküllerin ortasında yatay olarak kesin (Şekil 1C). Sol ventrikülü aorta doğru kesin ve aort kapağını dikkatlice inceleyin (Şekil 1D-F). Valfleri 35 mm'lik küçük bir doku kültürü kabında bir araya getirin.
- İzole edilmiş valfleri 75 mm'lik bir hücre kültürü kabında, kanı çıkarmak için antibiyotiklerle (%1 penisilin-streptomisin) takviye edilmiş 5 mL soğuk HEPES (10 mM) ile yıkayın (Şekil 2). Yukarıda adım 1.3.
'de açıklandığı gibi iki adet 15 mL'lik kollajenaz 1 mg / mL ve 4.5 mg / mL tüpü hazırlayın
not: Diseksiyondan sonra, kontaminasyonu en aza indirmek için izole edilmiş valfleri steril bir biyogüvenlik başlığında manipüle edin.
- Kollajenaz tip I'deki (1 mg/mL) valfleri sürekli çalkalama ile 37 °C'de 30 dakika inkübe edin (Şekil 2). Tüpü 150 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, peleti bir kez 2 mL HEPES (10 mM) ile yıkayın ve yüksek hızda 30 saniye boyunca girdap yapın. Bu tüpün içindekileri 35 mm'lik bir kültür kabına dökün ve ince cımbız kullanarak doku parçalarını dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
not: Bu aşamada, VIC'ler hala dokudan ayrılmamıştır ve pelet doku parçaları içerir. Endotel hücreleri ile kontaminasyonu önlemek için, adım 2.5'te girdaplamadan sonra santrifüj yapmayın.
- Pelet, 5 mL kollajenaz tip I (4.5 mg / mL) ile 15 mL'lik bir tüpte 37 ° C'de 35 dakika boyunca sürekli çalkalama altında inkübe edin. Hücreleri ayırmak için hücreleri 1 mL'lik bir pipetle tekrar askıya alın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 2 mL tam DMEM'de yeniden süspanse edin. 150 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri temizlemek için bu adımı iki kez tekrarlayın.
not: Pelet hala bazı doku parçalarına sahip olacaktır.
- Peletleri 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri, kültür kabına bağlanmalarını kolaylaştırmak için minimum miktarda ortamda 6 oyuklu bir hücre kültürü kabının bir oyuğuna yerleştirin. Hücreleri, %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde rahatsız edilmeden bırakın.
- 3 gün sonra, doku kalıntılarına yakın iyi bir büyüme olduğunu doğrulamak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Mikroskop altında 1.000 hücre göründüğünde, doku kalıntılarını otoklavlanmış cımbızla dikkatlice çıkarın ve ortamı değiştirin.
not: Plaka rahatsız edilmemelidir; Gerekli sayıda hücre gözlenmezse, hücre kültürü kabını 2 gün daha inkübatöre geri koyun.
- Hücreler %70 birleştiğinde (2,5 × 105), tripsinize edin ve ardından bunları 75 mm'lik bir doku kültürü kabına aktarın.
3. İn vitro kalsifikasyon testi
- Davlumbazı %70 etanol ile temizleyin, DMEM ortamını 37 °C'ye ısıtın.
- 100.000 hücreyi / koşulu tam DMEM'de 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve 37 ° C'de 24 saat boyunca kültürleyin.
- DMEM'de 2 mM NaH2PO4, 10-7 M insülin ve 50 μg/mL askorbik asidi %5 FBS ile karıştırarak kalsifiye edici ortamı hazırlayın. 93 mL DMEM için 5 mL FBS, 1 mL antibiyotik (son konsantrasyon% 1), 1 mL sodyum piruvat (100 mM), 27.5 mg NaH2PO4, 5.8 μL insülin ve 5 mg askorbik asit ekleyin.
NOT: Kullanmadan önce çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin.
- 24 saat sonra, süpernatan ortamı kalsifiye edici ortamla değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de 7 gün boyunca inkübe edin. 3. günde, taze kalsifiye edici ortamla değiştirin ve 7 günlük tedaviyi tamamlamak için plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin.
- 7 gün sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 2 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 1 mL 0.6 N hidroklorik asit (HCl) içinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin. HCl'yi 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın ve döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırın. Tüm tüplerin içeriğini 60 μL HCl.
içinde yeniden süspanse edin
not: Kurutma prosedürü, çözeltiyi konsantre etmek ve her koşul için aynı hacme sahip olmak için önemlidir.
- Kullanıma hazır bir kitte bulunan Arsenazo III reaktifini kullanarak kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için 96 oyuklu bir plaka kullanın (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakın).
- 10 mg/dL konsantrasyonlu bir kalsiyum standart çözeltisi hazırlayın. 10 mg kalsiyum hidroksit (Ca(OH)2) tartın ve 100 mL damıtılmış suda çözün.
- Berrak 96 oyuklu bir plakada, 2 μL boş çözelti (HCl, 0.6 N), standart çözelti, kuyucuk başına numune (10 mg/dL) ve numuneleri pipetleyin. Pipetleme değişkenliğini doğrulamak için deneyi üç nüsha halinde gerçekleştirin. Her koşul için 200 μL reaktif ekleyin.
not: 15 mg / dL'nin üzerindeki numuneler 1: 1 oranında tuzlu su ile seyreltilmeli, yeniden test edilmeli ve sonuç iki ile çarpılmalıdır.
- Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
not: Reaksiyon 60 dakika boyunca stabildir.
- Plakanın emilimini 650 nm'de okuyun ve kaydedin. Numunelerdeki kalsiyum miktarını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
Kalsiyum (mg/mL) = (Numunenin emilmesi/standardın emilmesi) × Standardın konsantrasyonu
