Balık Embriyolarında PM2.5 Aracılı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofloresan Testi

Özet

Kaynak: Huang, Y., et al. Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM_2.5 ile İndüklenen DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofloresan Kullanma. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, sırasıyla DNA hasarını ve çift sarmallı DNA kırılmalarını gösteren 8-OHdG ve γH2AX seviyelerini ölçerek zebra balığı embriyolarının kalplerinde PM_2.5'in neden olduğu oksidatif hasarı tespit etmek için oldukça hassas bir immünofloresan tabanlı testi göstermektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. PM_2.5 örnekleme ve organik bileşik ekstraksiyonu

NOT: PM_2.5, daha önce açıklandığı gibi 1-7 Ağustos 2015 tarihleri arasında Çin'in Suzhou kentindeki bir kentsel alanda toplanmıştır.

1. Organik bileşenleri çıkarmak için 47 mm kuvars membran filtrelerini 500 °C kül fırınında 2 saat pişirin.
2. 24 saat kesintisiz örnekleme için PM_2.5 örnekleyiciye bir filtre yerleştirin.
3. Filtreyi çıkarın ve oda sıcaklığında 24 saat kurutun.
4. Filtreyi bir analitik terazi ile ölçün.
5. Çözücü olarak diklorometan kullanarak Soxhlet ekstraksiyonu ile filtreden organik bileşenleri çıkarın.
6. EOM'yi 60 °C'lik bir su banyosunda ve nitrojen akışında döner buharlaştırma ile kurutun. EOM'u DMSO'da çözün ve -20 °C'de saklayın.

2. Zebra balığı embriyo toplama ve tedavisi

1. Zebra balığını 28.5 ± 0.5 °C'de, 14 saat ışık ve 10 saat karanlık fotoperiyot döngüsü ile yeniden sirkülasyonlu bir su ürünleri yetiştiriciliği sisteminde tutun.
2. Sağlıklı yetişkin zebra balıklarını 2: 1 erkek-dişi oranında bir tanka yerleştirin.
3. Ertesi gün, embriyoları toplayın ve sistem suyu (yani zebra balığı yetiştirme suyu) ile yıkayın.
4. Normal bir gelişim gösteren zebra balığı embriyolarını seçin ve rastgele bölün (tek tip boyut, tam tahıllar ve yumurta pıhtılaşması yok) 7 cm çapında (tabak başına yaklaşık 50 embriyo) ayrı cam Petri kaplarında 4 gruba.
5. Embriyoları PM_2.5 (5 mg / L) ile NAC varlığında veya yokluğunda 0.25 μM'de 2 hpf'den 72 hpf'ye kadar tedavi edin. DMSO'yu %0,1'lik (h/v) nihai konsantrasyona kadar araç kontrolü olarak kullanın.

3. Zebra balığı embriyolarının morfolojik gözlemi ve kardiyak diseksiyon

1. 72 hpf'de embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değişmiş döngü ve azalmış boyut gibi kalp malformasyonlarını kaydedin.
2. Malformasyon oranlarını (toplam canlı embriyolar içinde kalp kusurlu embriyoların yüzdesi) hesaplayın ve tek yönlü ANOVA ve ardından Türkiye'nin Çoklu Karşılaştırma Testini kullanarak gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin (p < 0.05 = istatistiksel olarak anlamlı).
3. Embriyoları 0.6 mg / mL MS-222 ile uyuşturun ve cam slaytlar üzerinde hareketsiz hale getirin.
4. ImageJ yazılımını kullanarak 30 saniye boyunca kalp atışlarını kaydedin ve kalp atış hızlarını ölçün.
5. Stereo mikroskop altında tek kullanımlık bir şırınga iğnesi ile zebra balığı embriyolarından kalpleri inceleyin. Dikkat: Kalp şeklini bozmaktan kaçının.

4. İmmünofloresan Testi

1. Zebra balığı embriyolarının kalbinde PM_2.5'in neden olduğu DNA hasarını tespit etmek için bir immünofloresan testi kullanmak için, temiz bir cam tarafa bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
2. Fiksatif bir çözelti yapmak için 1.25 mL Fosfat Tamponlu Salin'e (PBS) 50 μL% 4 paraformaldehit ekleyin.
3. Parçalanmış 3 kalbi bir hidrofobik bariyer kalem çemberine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
4. Solüsyonu mikroskop altında boşaltın ve numuneleri oda sıcaklığında en az 5 dakika kurutun, böylece kalpler cam slaytlara tamamen yapışır.
5. Slaytları PBS'de %0,1 Tween 20 (PBST) ile yıkama başına 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
6. % 5'lik bir BSA çözeltisi elde etmek için 1000 μL PBST'ye 50 μL sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için slaytları nemli bir odada 1 saat inkübe edin.
7. Solüsyonu boşaltın ve numuneleri yıkama başına 5 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.
8. Çalışan bir birincil antikor kokteyli çözeltisi elde etmek için 8-OHdG'ye karşı 2 μL fare monoklonal antikorunu ve γH2AX'e karşı 2 μL tavşan poliklonal antikorunu 296 μL seyreltin.
9. Kalp örneklerini 8-OHdG ve γH2AX'e karşı 50 μL birincil antikor kokteyl çözeltisi ile nemlendirilmiş bir odada en az bir saat oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (Gece boyunca inkübasyon sinyal yoğunluğunu artırabilir).
10. Solüsyonu boşaltın ve numuneleri yıkama başına 5 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.
11. Çalışan bir ikincil antikor kokteyli çözeltisi elde etmek için 1 μL FITC etiketli keçi anti-fare ikincil antikoru ve 1 μL cy3 keçi anti-tavşan ikincil antikorunu 498 μL PBST içinde seyreltin ve numuneleri ikincil antikorlarla inkübe edin (PBST'de 1:500) karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat.
12. Solüsyonu boşaltın ve numuneleri ışıktan koruyarak yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
13. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nükleer boyama için numunelere 20 μL DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ekleyin.
14. Kurumasını ve hareket etmesini önlemek için oje ile kaydırmak ve kapatmak için bir lamel uygulayın. Ardından numuneleri bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. DMSO kontrol örneklerinin ortalaması ile nispi değişiklikleri hesaplayın. Adım 3.2'deki gibi verilerin istatistiksel anlamlılığını belirleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
8-OHdG Antikoru	Santa Cruz Biyoteknoloji, ABD	SC-66036	Birincil antikor
Analitik terazi	Sartorius, Çin	BSA124S
Bsa	Solarbio, Pekin, Çin	SW3015	Engellemek için
DAPI (DAPI	Abcam, Amerika Birleşik Devletleri	AB104139	Nükleer karşı leke için.
DMSO (Türkçe)	Solarbio, Pekin, Çin	D8371
Floresan mikroskobu	Olimpos, Japonya	IX73	Floresan sinyallerini görüntülemek için
Keçi Anti-Tavşan IgG Cy3	Carlsbad, Amerika Birleşik Devletleri	CW0159	İkincil antikor
Keçi Anti-Tavşan IgG FITC	Carlsbad, Amerika Birleşik Devletleri	RS0003	İkincil antikor
N-Asetil-L-sistein (NAC)	Adamas-Beta, Şangay, Çin	616-91-1
Yörünge çalkalayıcı	QILINBEIER, Çin	TS-1
Paraformaldehit	Sigma, Çin	P6148 Serisi	Fiksasyon için% 4 paraformaldehit yapın.
Fosfat Tamponlu Tuzlu	HyClone, Amerika Birleşik Devletleri	SH30256.01	Yıkama için PBS'de% 0.1 Tween hazırlayın.
PM2.5 örnekleyici	TianHong, Wuhan, Çin	TH-150C	24 saat kesintisiz PM2.5 örneklemesi için.
Devridaim su ürünleri yetiştiriciliği sistemi	HaiSheng, Şangay, Çin		Zebra balığı içinde tutuldu.
Soxhlet çıkarıcı	ZhengQiao, Şangay, Çin	BSXT-02	Organik bileşenlerin ekstraksiyonu için.
Stereomikroskop	Nikon, Kanada	SMZ645	Zebra balığı embriyolarından kalp diseeksiyonu için.
Trikain metansülfonat (MS222)	Sigma, Çin	E10521	Zebra balığı embriyolarını uyuşturmak için
Ara 20	Sigma, Çin	P1379 Serisi
γH2AX Antikoru	Abcam, Amerika Birleşik Devletleri	AB26350	Birincil antikor

Serisi Serisi ) (İngilizce) Serisi Serisi Serisi Serisi Tezli Yüksek Lisans Su Serisi Serisi Serisi Serisi