$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Rinal korteks-hipokampus dilimlerinin hazırlanması
NOT: Rinal korteks-hipokampus dilimlerinin hazırlanmasında P6-7 Sprague-Dawley sıçanları kullanılır.
- Kültür kurulumu ve besiyeri hazırlama
- Kültürden bir gün önce gerekli besiyerini hazırlayın ve 4 °C'ye yerleştirin.
- Diseksiyon ortamını hazırlayın: Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (GBSS) 25 mM glikoz.
- Kültür ortamını hazırlayın:% 50 Opti-MEM,% 25 HBSS,% 25 At Serumu (HS), 25 mM glikoz, 30 μg / mL Gentamisin.
- Bakım ortamını hazırlayın: Neurobazal-A (NBA),% 2 B27, 1 mM L-glutamin, 30 μg / mL Gentamisin, HS (% 15,% 10,% 5 ve% 0).
- Beyin hasadı
- Kültüre başlamadan hemen önce, bir P1000 pipeti ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1,1 mL kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'ye yerleştirin.
- Tüm ekipmanı (diseksiyon mikroskobu, doku doğrayıcı, diseksiyon lambası, diseksiyon aletleri, elektrotlar, plakalar, ekler ve filtre kağıtları) biyolojik güvenlik kabininin içine yerleştirin ve UV ışığı altında 15 dakika sterilize edin.
- Dilim kalınlığını 350 μm'ye ayarlayın.
- GBSS'yi buzdolabından çekin. Altı Petri kabına 5 mL GBSS ekleyin. Hayvan başına altı Petri kabı gerekecektir.
- Sıçan yavrusuna ötenazi yapın. Hayvanın beyin sapının tabanında keskin bir makas kullanarak kafa kesme işlemi gerçekleştirin.
- Hayvan kafasını soğuk GBSS'de üç kez yıkayın ve güvenlik kabininin içine alın.
- Doku izolasyonu ve dilimlerin hazırlanması
- Kafayı tutmak için keskin forsepsleri göz yuvalarına sıkıca yerleştirin.
- İnce bir makas kullanarak, vertebral foramenden başlayarak frontal loblara doğru orta hat boyunca cildi/kafa derisini kesin ve bir kenara koyun.
- Kafatasını ve serebral transvers fissür (beyin ve beyincik arasındaki boşluk) boyunca aynı şekilde kesin. Kavisli uzun forseps ile ayırın.
- Koku ampullerini bir spatula ile atın. Beyni kafadan çıkarın ve sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde buz gibi GBSS'ye yerleştirin (Şekil 1A).
- İnce forsepsleri beyinciklere yerleştirin ve spatula ile orta hat boyunca ilerleyin, her yarım küreyi çok dikkatli bir şekilde açın (Şekil 1B).
- Kısa eğri forsepslerle, hipokampal yapıya dokunmadan, hipokampusu kaplayan fazla dokuyu dikkatlice çıkarın. Daha sonra bir spatula ile her hipokampusun altını kesin (Şekil 1C).
- Bir yarım küre alın ve hipokampus yukarı bakacak şekilde bir filtre kağıdına yerleştirin. Prosedürü diğer yarım küre ile tekrarlayın ve filtre kağıdına birincisine paralel olarak yerleştirin. Filtre kağıdını, yarım küreler bıçağa dik olacak şekilde doku kıyıcının üzerine koyun ve yarım küreleri 350 μm'lik dilimler halinde kesin (Şekil 1D).
- Dilimlenmiş dokuyu soğuk GBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1E).
- Yuvarlak uçlu elektrotları kullanarak dilimleri dikkatlice ayırın (Şekil 1F). Sadece yapısal olarak sağlam bir rinal korteks ve hipokampus ile dilimleri saklayın. DG ve CA alanlarının yanı sıra entorinal ve perirhinal korteks de mükemmel bir şekilde tanımlanmalıdır (Şekil 1G).
- Her dilimi bir spatula ve yuvarlak uçlu bir elektrot ile ek parçanın üzerine yerleştirin (Şekil 1H-I). Bir P20 pipeti ile her dilimin etrafındaki fazla diseksiyon ortamını çıkarın (Şekil 1J). Dört rinal korteks-hipokampus dilimi tek bir ekte kültürlenebilir (Şekil 1K).
- Kültür bakımı
- Ortamı iki günde bir değiştirin.
- Ortamı 37 °C'de ısıtın.
- Plakaları inkübatörden alın. Plastik kenarı forseps ile tutarak her bir parçayı alın (Şekil 1L).
- Ortamı kuyudan aspire etmek için serbest bir el kullanın. Ek parçayı tekrar kuyuya yerleştirin ve bir P1 pipet ile 1000 mL taze ısıtılmış ortam ekleyin (Şekil 1M). Tüm ekler için tekrarlayın. Membran ile ortam arasında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.
not: Epileptik benzeri dilimler, ortamda kademeli ve kontrollü bir serum yoksunluğuna uğrar. 9 Days In Vitro'dan (DIV) itibaren, dilimler NBA'de HS olmadan korunur.
2. Elektrofizyolojik kayıtlar
NOT: Elektrofizyolojik kayıtlar, arayüz tipi bir odacıkta 7, 14 ve 21 DIV'de rinal korteks-hipokampus organotipik dilimlerde yapıldı. Kayıtlar bir amplifikatör ile elde edildi, sayısallaştırıldı ve yazılım ile analiz edildi. Tüm kayıtlar bant geçiren filtreliydi (60 Hz'de sekiz kutuplu Bessel filtresi ve 600 Hz'de Gauss filtresi).
- Kurulum hazırlığı
- 1 mL B27 ve 250 μL L-Glutamin ile 50 mL NBA ortamı hazırlayın. 37 °C'de ısıtın.
- Elektrofizyoloji kurulumunu kapalı bir devreye ayarlayın. Akış hızının 2 mL/dak olup olmadığını doğrulayın.
- Carbox (%5 CO2/%95 O2) vanasını açın ve sistemdeki su seviyesini kontrol edin.
- Fazla ortamı boşaltmak için filtre kağıdını arayüz kayıt odasına ve dilime ortam sağlamak için lens temizleme kağıdını çerçevenin altına koyun.
- Sıcaklık kontrol cihazını, amplifikatörleri ve mikromanipülatörü açın.
- Kayıtlara başlamadan önce arayüz odasındaki sıcaklığın 37 °C'de sabitlenmesini bekleyin.
- Yapay beyin omurilik sıvısı hazırlayın (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glikoz, 2 mM CaCl2, 1 mM MgM 4 pH 7.4 ile) ve cam elektrodu bir şırınga ile doldurmak için kullanın. Alıcı elektroda yerleştirin.
- Spontan aktivite kayıtları
- Sıcaklık sabit olduğunda, plakayı inkübatörden çıkarın ve çok keskin bir bıçakla ek parçadan bir dilim kesin. Bir damla orta ile 60 mm'lik bir plakaya yerleştirin. Arayüz kayıt odasına götürün.
- Dilimi, hipokampus sağ altta olacak şekilde arayüz odasına yerleştirin. Alıcı elektrodu CA3 piramidal hücre katmanına yerleştirin.
- Sürekli alım protokolüne geçin ve 30 dakika boyunca kayıt yapın.
