Ex Vivo Epilepsi Modelinde Hücre Ölümünü Değerlendirmek İçin Nöronal Ölüm Testi

Özet

Kaynak: Carvalho, M., et al., Rhinal Cortex-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Bir Epileptogenez Modeli. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, rinal korteks-hipokampus organotipik dilimlerinde nöronal ölümü değerlendirme tekniğini göstermektedir. Nöronal ölüm, in vivo epilepsiye benzeyen gelişen epileptik nöbetler yoluyla meydana gelir ve propidyum iyodür ve immünofloresan kullanılarak ölü hücrelerin çift boyanması yoluyla tespit edilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Rinal korteks-hipokampus dilimlerinin hazırlanması

NOT: Rinal korteks-hipokampus dilimlerinin hazırlanmasında P6-7 Sprague-Dawley sıçanları kullanılır.

1. Kültür kurulumu ve besiyeri hazırlama
   1. Kültürden bir gün önce gerekli besiyerini hazırlayın ve 4 °C'ye yerleştirin.
   2. Diseksiyon ortamını hazırlayın: Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (GBSS) 25 mM glikoz.
   3. Kültür ortamını hazırlayın:% 50 Opti-MEM,% 25 HBSS,% 25 At Serumu (HS), 25 mM glikoz, 30 μg / mL Gentamisin.
   4. Bakım ortamını hazırlayın: Neurobazal-A (NBA),% 2 B27, 1 mM L-glutamin, 30 μg / mL Gentamisin, HS (% 15,% 10,% 5 ve% 0).
2. Beyin hasadı
   1. Kültüre başlamadan hemen önce, bir P1000 pipeti ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1,1 mL kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'ye yerleştirin.
   2. Tüm ekipmanı (diseksiyon mikroskobu, doku doğrayıcı, diseksiyon lambası, diseksiyon aletleri, elektrotlar, plakalar, ekler ve filtre kağıtları) biyolojik güvenlik kabininin içine yerleştirin ve UV ışığı altında 15 dakika sterilize edin.
   3. Dilim kalınlığını 350 μm'ye ayarlayın.
   4. GBSS'yi buzdolabından çekin. Altı Petri kabına 5 mL GBSS ekleyin. Hayvan başına altı Petri kabı gerekecektir.
   5. Sıçan yavrusuna ötenazi yapın. Hayvanın beyin sapının tabanında keskin bir makas kullanarak kafa kesme işlemi yapın.
   6. Hayvan kafasını soğuk GBSS'de üç kez yıkayın ve güvenlik kabininin içine alın.
3. Doku izolasyonu ve dilimlerin hazırlanması
   1. Kafayı tutmak için keskin forsepsleri göz yuvalarına sıkıca yerleştirin.
   2. İnce bir makas kullanarak, vertebral foramenden başlayarak frontal loblara doğru orta hat boyunca cildi/kafa derisini kesin ve bir kenara koyun.
   3. Kafatasını ve serebral transvers fissür (beyin ve beyincik arasındaki boşluk) boyunca aynı şekilde kesin. Kavisli uzun forseps ile ayırın.
   4. Koku ampullerini bir spatula ile atın. Beyni kafadan çıkarın ve sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde buz gibi GBSS'ye yerleştirin (Şekil 1A).
   5. İnce forsepsleri beyinciklere yerleştirin ve spatula ile orta hat boyunca ilerleyin, her yarım küreyi çok dikkatli bir şekilde açın (Şekil 1B).
   6. Kısa eğri forsepslerle, hipokampal yapıya dokunmadan, hipokampusu kaplayan fazla dokuyu dikkatlice çıkarın. Daha sonra bir spatula ile her hipokampusun altını kesin (Şekil 1C).
   7. Bir yarım küre alın ve hipokampus yukarı bakacak şekilde bir filtre kağıdına yerleştirin. Prosedürü diğer yarım küre ile tekrarlayın ve filtre kağıdına birincisine paralel olarak yerleştirin. Filtre kağıdını, yarım küreler bıçağa dik olacak şekilde doku kıyıcıya koyun ve yarım küreleri 350 μm'lik dilimler halinde kesin (Şekil 1D).
   8. Dilimlenmiş dokuyu soğuk GBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1E).
   9. Yuvarlak uçlu elektrotları kullanarak dilimleri dikkatlice ayırın (Şekil 1F). Sadece yapısal olarak sağlam bir rinal korteks ve hipokampus ile dilimleri saklayın. DG ve CA alanlarının yanı sıra entorinal ve perirhinal korteks de mükemmel bir şekilde tanımlanmalıdır (Şekil 1G).
   10. Her dilimi bir spatula ve yuvarlak uçlu bir elektrot ile ek parçanın üzerine yerleştirin (Şekil 1H-I). Bir P20 pipeti ile her dilimin etrafındaki fazla diseksiyon ortamını çıkarın (Şekil 1J). Dört rinal korteks-hipokampus dilimi tek bir ekte kültürlenebilir (Şekil 1K).
4. Kültür bakımı
   1. Ortamı iki günde bir değiştirin.
   2. Ortamı 37 °C'de ısıtın.
   3. Plakaları inkübatörden alın. Plastik kenarı forseps ile tutarak her bir parçayı alın (Şekil 1L).
   4. Ortamı kuyudan aspire etmek için serbest bir el kullanın. Ek parçayı tekrar kuyuya yerleştirin ve bir P1 pipet ile 1000 mL taze ısıtılmış ortam ekleyin (Şekil 1M). Tüm ekler için tekrarlayın. Membran ile ortam arasında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.
      not: Epileptik benzeri dilimler, ortamda kademeli ve kontrollü bir serum yoksunluğuna uğrar. 9 Days In Vitro'dan (DIV) itibaren, dilimler NBA'de HS olmadan korunur.

2. PI alım testi

NOT: Hücre ölümü, floresan boya propidyum iyodürün (PI) hücresel alımının izlenmesiyle değerlendirildi. PI, hasarlı hücre zarlarına sahip hücrelere giren ve kırmızı floresan yayan DNA ile etkileşime giren polar bir bileşiktir (absorbans 493 nm, emisyon 630 nm). PI canlı hücrelere özgü olmadığından, bir popülasyondaki ölü hücreleri tespit etmek için kullanılır.

1. PI inkübasyonu
   1. Kültür ortamında, taze bir 1:10 oranında PI stoğu seyreltmesi hazırlayın.
   2. PI alım tahlili için, plakayı inkübatörden çıkarın ve eki dikkatlice kaldırın. Bir P20 pipeti ile ortama 13 μL PI ekleyin ve 2 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Ek parçayı tekrar yerine koymadan önce plakayı yavaşça çalkalayın. Dilimlerin altında kabarcık olmadığından emin olun.
   3. Dilimleri 37 °C'lik inkübatörde 2 saat bekletin.
   4. Bir sonraki bölümde açıklandığı gibi immünohistokimya protokolüne devam edin. PI ışığa duyarlı olduğu için plakaları alüminyumla kaplayın.

3. İmmünohistokimya

NOT: İmmünohistokimyada, rinal korteks-hipokampus epileptik benzeri organotipik dilimlerde nöronal ölüm ve gliozis derecesini değerlendirmek için nöron spesifik bir antikorun yanı sıra mikroglia ve astrositlerin dinlenme ve reaktif fenotiplerini ayırt edebilen antikorlar kullanıldı.

1. Doku fiksasyonu
   1. Plakayı inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin. Dilimleri RT'de 1 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin, dilimlerin altına ve üstüne 1 mL PFA ekleyerek bir P1000 pipeti ile sabitleyin.
   2. PFA'yı çıkarın ve 1 mL PBS ekleyin. Ayrıca, dilimlerin altına ve üstüne PBS ekleyin.
   3. Dilimleri daha fazla kullanana kadar PBS'de 4 °C'de tutun. Kurumasını önlemek için her zaman plakaların etrafına parafilm sürün.
2. İmmün boyama adımları
   1. Her seferinde 10 dakika olmak üzere iki kez 1 mL PBS ile yıkayın.
   2. PBS'de %1 Triton-X100, %10 HS ve %10 BSA içeren geçirgenlik/blokaj solüsyonu hazırlayın. % 5 BSA çözeltisi hazırlayın.
   3. Hidrofobik kalemle iki dikdörtgen çizin (Şekil 2A). Kesici uçtaki dilimleri (Şekil 2B) çok keskin bir bıçakla kesin. Slayt başına iki dilim koyun (Şekil 2C) ve bir P140 pipeti kullanarak her dilimin üstüne 200 μL geçirgenlik/engelleme solüsyonu ekleyin. RT'de 3 saat inkübe edin.
   4. Birincil antikorları PBS'de% 5 BSA'da çalışma seyreltmesine seyreltin. Birincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   5. RT'de 4 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu adımdan itibaren, floroforlarla çalışıldığı için plakayı ışıktan koruyun.
   6. Her dilimin üstüne 50 μL'lik bir damla Hoechst çözeltisi yerleştirin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
   7. Kuluçka dönemleri arasında yıkayın. PBS-T ile her seferinde 10 dakika boyunca her zaman üç kez yıkayın.
   8. Hoechst'i çıkarın ve önerildiği gibi yıkayın.
   9. Her dilimin üstüne 50 μL montaj ortamı ekleyin. Bir cam lamel ile örtün ve oje ile çevreleyin (Şekil 2D).
   10. RT'de 24 saat kurumaya bırakın.
   11. İmmün boyamayı konfokal mikroskop altında görselleştirin. Lekeli dilimleri -20 °C'de tutun.

Sonuçlar

Şekil 1: Rinal korteks-hipokampus organotipik dilimlerinin hazırlanması için ayrıntılı prosedür. (A) Beyni kafadan çıkarın ve sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde buz gibi GBSS'ye yerleştirin. (B) Forsepsleri beyinciklere yerleştirin. Beyni orta hattan açın ve hipokampus üzerindeki fazla dokuyu çıkarın. (C) Oklarla gösterildiği gibi hipokampusun altından kesilmiş bir spatula ile. (

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
50 mL Santrifüj Tüpü, Konik Tabanlı	Corning	430829
% 70 Etanol	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Anti-NeuN (tavşan)	Werfen	16712943S	1:500 oranında seyreltin
B-27™ Takviyesi (50X), serumsuz	Thermo Fisher Bilimsel	17504-044
Neşter sapı için bıçaklar	Güzel Bilim Araçları	10011-00
Sığır Serum Albümini (BSA)	NZYTech (İngilizce	MB04602	Primer antikorları seyreltmek için %5 BSA kullanılır. 10 mL PBS'ye 0,5 g BSA ekleyin.
Beyin/Doku Dilim Odası Sistemi	Warner Enstrümanları
Hücre kültürü ekleri, 30 mm, hidrofilik PTFE	Kırlangıç SAS	PICM03050
Soğuk ışık kaynağı	Schott	KL 300 LED
Konfokal lazer mikroskobu	Zeiss	LSM 710
Konvansiyonel kuluçka makinesi	Termo Bilimsel Heraeus	BB15, Fonksiyon Hattı	37 °C ve %5 CO2'ye ayarlayın
D (+) - Glikoz monohidrat	Merck Kırlangıç	1.08342.1000
D-(+)-Glikoz çözeltisi, suda %45	Sigma	G8769
di-Sodyum hidrojen fosfat dihidrat	Merck Milipore	1.06580.1000
Diseksiyon mikroskobu/büyüteç	MEIJI TEKNO LTD ŞTİ	122285
Alexa Fluor 488 ile birleştirilmiş eşek anti-tavşan IgG (H + L)	Canlandırıcı	A21206	1:500 oranında seyreltin
Dumont #5 İnce Forseps Biologie Inox	Güzel Bilim Araçları	11254-20
Dumont #5 Forseps Standart Inox	Güzel Bilim Araçları	11251-20
Dumont #7 Forseps Standart Dumoxel	Güzel Bilim Araçları	11271-30
Dumont Medical #7S Forseps Kısa Eğri Inox	Güzel Bilim Araçları	11273-22
Gentamisin stok çözeltisi, 50 mg / mL	Thermo Fisher Bilimsel	15750-037
Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisi (GBSS)	Biyolojik Endüstriler	01-919-1A
Cam Elektrotlar	Bilim Ürünleri	GB150F-10	Yuvarlak ipuçları ev yapımı
Cam Pastör pipetleri, 230 mm	VWR Uluslararası	612-1702
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Thermo Fisher Bilimsel	24020-091
At Serumu, Isı İnaktive Edilmiş (HS)
hidroklorik asit	Thermo Fisher Bilimsel	26050-088
Hidrofobik Kalem	Merck Milipore	1.09057.1000
INCU-Hattı IL10	Dako Belediyesi	S200230-2
İris Spatula Kavisli	Warner Enstrümanları	BSC-HT Haas Üst
Laboratuvar Kültürü Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini	Güzel Bilim Araçları	10092-12
Lens Temizleme Kağıdı	HERASafe	HS 12
L-Glutamin çözeltisi 200 mM (Q)	SERTLEŞME
Mikro tüp 0,5 mL, PP	Merck Kırlangıç	1.05886.0500
Mikro tüp 1,5 mL, PP	SARSTEDT	72.699
Mikro tüp 2.0 mL, PP	SARSTEDT	72.690.001
Mikrooskop Kapak Camları, 24 mm x 60 mm	Sutter Enstrümanı	MP-285
oje	Marienfeld	102242
Nörobazal-A Orta (NBA)	Klişe
Opti-MEM® I İndirgenmiş Serum Ortamı	Thermo Fisher Bilimsel	10888-022
Paraformaldehit, toz	Thermo Fisher Bilimsel	31985-047
Peristaltik pompa	VWR Kimyasalları	2,87,94,295
Fosfat tuzlu su tamponu (PBS)	Gilson	M312
Fosfat standart çözeltileri, PO43- suda			Ev yapımı. İmmünohistokimya testi sırasında dilimleri yıkamak için %0.5 Tween-20 (PBS-T) içeren PBS kullanılır.
Pipet seti	BDH ARISTAR	452232C
Platin 5 bıçak	Gilson	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Propidyum iyodür (PI)	Sigma-Aldrich	P5405-250g
Kalitatif Filtre Kağıdı, Selüloz, Grade 1, 55 mm	Sigma-Aldrich	P4170-25MG	Çözeltiyi 1 mg / mL'de suda stoklayın.
Kalitatif Filtre Kağıdı, Selüloz, Grade 1, 90 mm	Ne adam	1001-055	Orta tutma 11μm
Neşter sapı	Ne adam	1001-090	Orta tutma 11μm
İğnesiz Kayma Uçlu İnsülin Şırıngası 1 mL	Güzel Bilim Araçları	91003-12
Öğrenci Makası Düz SharpSharp 12cm	Astro Med Inc GRASS Ürün Grubu	S48 Stimülatör
SuperFrost Plus™ Yapışma kızakları	Güzel Bilim Araçları	91402-12
TC ile İşlem Görmüş Steril 60 x 15mm Doku Kültürü Kabı	Thermo Fisher Bilimsel	J1800AMNZ
TC ile İşlem Görmüş Steril 6 Kuyulu Plakalar	Corning	CORN430166
Doku Doğrayıcı	MEDİKAL SİSTEMLER A.Ş.	TC-102
Triton X-100	Mickle Laboratuvar Mühendislik A.Ş. LTD.	MTC/2	350 μm'ye ayarlayın
Ara-20	BDH (Türkçe)	14630
	Sigma	P2287 Serisi

Serisi ) Serisi Serisi Serisi Serisi adet Serisi Belediyesi Serisi Gazetesi Gazetesi (İngilizce) Serisi Serisi Serisi