Solucanlardaki Bir Bileşiğin Nöroprotektif Etkisini Belirlemek için PolyQ Agregasyon Testi

Özet

Kaynak: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans, poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfi için bir model sistem olarak. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, nematodların vücut duvarı kas hücrelerinde poliQ agregasyonunu azaltmada ve agregasyonla ilişkili proteotoksisiteyi iyileştirmede nöroprotektif test bileşiklerinin koruyucu potansiyelini taramak için in vivo bir yöntem açıklanmaktadır.

Protokol

1. PolyQ toplama tahlili

1. PolyQ agregasyon deneyi için nematodların hazırlanması
   1. AM141'in 300-500 senkronize L1 larvasını, OP50 (OD₅₇₀ 0.7-0.8) ve 5 mg / mL astragalan içeren 500 μL S ortamı içeren 48 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın, tipik olarak bir zaman noktası için tedavi başına bir kuyucuk.
   2. Plakayı parafilm ile kapatın ve 24, 48, 72 ve 96 saat boyunca 20 ° C ve 120 rpm'de inkübe edin.
   3. Nematodları steril 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde hasat edin ve kalan OP50'yi çıkarmak için M9 tamponu ile >3 kez santrifüjleme (1 dakika boyunca 1000 × g) ile yıkayın. AM141 nematodlarını M9 tamponunda yeniden süspanse edin ve görüntü elde etmek için hazır tutun.
2. Floresan görüntülerin elde edilmesi ve veri analizi
   NOT: Veriler, bu yüksek içerikli görüntüleme sistemi ile otomatik olarak analiz edilir. Otomatik bir görüntüleme cihazı mevcut değilse, ortak bir floresan mikroskobu kullanarak benzer performansı elde etmek için görüntü elde etmek için bir agaroz pedi hazırlamak için geleneksel bir yöntem kullanılabilir.
   1. 384 oyuklu bir plakada (son hacim oyuk başına 80 μL) her bir oyuğa 10-15 nematod aktarın. Her tedavi için 10 çoğaltma kuyusu ayarlayın.
   2. Nematodları felç etmek ve dibe çökmelerini sağlamak için her kuyucuğa 10 μL 200 mM sodyum azid ekleyin (5-10 dakika).
   3. Floresan görüntüler elde etmek için plakayı yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine yerleştirin (cihaz ve yazılım bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın).
   4. Görüntü alma yazılımını açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      1. Plaka Edinme Kurulumu penceresini açın ve yeni bir deney seti ve adı oluşturun.
      2. Büyütme'yi 2x olarak, Kamera gruplamasını 1 olarak ve Plaka türünü 384 kuyucuklu plaka olarak seçin.
      3. Ziyaret edilecek kuyuları ve siteleri (tek site) ayarlayın.
      4. Floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresini seçin ve görüntü tabanlı odaklama seçeneklerini etkinleştirin.
      5. Pozlamayı 300 ms.
         olarak ayarlayın not: Görüntüleme parametrelerini optimize etmek için yukarıdaki ayarlar test edilebilir ve ayarlanabilir.
      6. Görüntü edinme ayarlarını kaydedin ve çalıştırmak için Plaka Al düğmesine tıklayın.
   5. Görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntü verilerini analiz edin.
      1. Plaka Verilerini Gözden Geçir penceresini açın ve görüntü analizi için Test plakasını seçin.
      2. Görüntüsünü görüntülemek için bir test kutusuna çift tıklayın.
      3. Analiz yöntemi olarak Count Nuclei'yi seçin ve aşağıdaki ayarlar için bir pencere açmak için Ayarları Yapılandır düğmesine tıklayın.
      4. FITC kanalından kaynak görüntüyü tanımlayın ve Standart Algoritma'yı seçin.
      5. Görüntü analizi parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: yaklaşık minimum genişlik = 10 μm (= 2 piksel); yaklaşık maksimum genişlik = 50 μm (= 12 piksel); yerel arka plan üzerindeki yoğunluk = 1.000-2.000 gri seviyesi.
      6. Analiz yöntemini optimize etmek için mevcut ayarları test edin.
      7. Ayarları kaydedin ve analizi tüm kuyularda çalıştırın.
         not: 384 oyuklu bir plaka için analizi bitirmek ~ 20 dakika sürer.
      8. Toplam Çekirdekleri, her bir kuyucuktaki toplam Q40::YFP agregalarının sayısı olarak dışa aktarın.
   6. Her kuyucuktaki nematod sayısını sayın.
   7. Her gruptaki nematod başına ortalama Q40::YFP agregalarının sayısını hesaplayın ve her zaman noktasından elde edilen verilere doğrusal olmayan bir eğri uyumu uygulayın.
   8. İnhibisyon indeksini hesaplayın:
      İnhibisyon indeksi = (N_kontrol - N_örnek) / Ncontrol
      N_kontrol ve N_numune, sırasıyla kontrol ve tedavi gruplarındaki Q40::YFP agregalarının ortalama sayısıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C. elegans suşu
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
E. coli suşu
OP50	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
reaktif
Sodyum azid	Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
ekipman
384 oyuklu hücre kültürü plakası	Nest Biyoteknoloji Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
48 oyuklu hücre kültürü plakası	Nest Biyoteknoloji Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
Floresan mikroskobu	Guangzhou Mikro Atış Optik Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
Yüksek içerikli görüntüleme sistemi	Moleküler Cihazlar	Görüntü X Basın	https://www.moleculardevices.com/ ürünleri/hücresel görüntüleme sistemleri#Yüksek İçerikli Görüntüleme
Mikrosantrifüj	Gen Şirketi	GENESPEED X1 IŞLEMCI DESTEĞI	https://www.genecompany.com/ index.php/Ev/Eşya/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Mikroskop dijital kamera	Guangzhou Mikro Atış Optik Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
yazılım
Görüntü elde etme ve analiz yazılımı	Moleküler Cihazlar	MetaXpress (MetaXpress)	https://www.moleculardevices.com/ ürünleri/hücresel-görüntüleme-sistemleri/ edinim-ve-analiz-yazılımı/ metaxpress