Solucanlarda PolyQ Aracılı Nörotoksisiteye Karşı Test Bileşiğinin Etkisini İncelemek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Wang, Q. ve diğerleri, Caenorhabditis elegans, Poliglutamin Aracılı Nörotoksisiteye Karşı Biyoaktif Bileşiklerin Keşfedilmesi İçin Bir Model Sistem Olarak. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, bir test bileşiği olan astragalan'ın, poliQ aracılı nörotoksisiteden Caenorhabditis elegans'ta nöronal sağkalım üzerindeki nöroprotektif etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Test, test bileşiği tedavisini takiben nöronal sağkalımı ölçmek için ASH nöronlarında GFP'ye kaynaşmış anormal şekilde genişlemiş poliQ tekrarlarını ifade eden Caenorhabditis elegans'ı kullanır.

Protokol

1. PolyQ aracılı nörotoksisite testi

1. C. elegans'ın test numuneleri ile tedavisi
   1. PoliQ nörotoksisite testi için nematodları hazırlamak için, HA759'un 300-500 senkronize L1 larvalarını, OP50 (OD₅₇₀ 0.7-0.8) ve 5 mg / mL astragalan içeren 500 μL S ortamı ile 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın; tipik olarak her tedavi için üç kopya kuyucuğu.
   2. Plakayı parafilm ile kapatın ve 3 gün boyunca 15 ° C ve 120 rpm'de inkübe edin.
   3. Nematodları santrifüjleme ile toplayın ve M9 tamponu ile 3-5 kez yıkayın. Nöronal sağkalım ve kaçınma deneylerinde kullanılmak üzere M9 tamponundaki nematodları yeniden süspanse edin.
2. Agaroz pedinin hazırlanması
   1. 100 mL M9 tamponuna (% 2, a / h) 2 g agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisini bir mikrodalgada kaynama noktasına kadar ısıtın.
   2. İki parça 2 mm kalınlığında cam plaka arasına yerleştirilmiş 1 mm kalınlığında bir mikroskopi cam slaytının ortasına 0,5 mL erimiş agaroz dağıtın. Dikey olarak başka bir slaytla örtün. Agaroz soğuduktan ve katılaştıktan sonra, üst sürgüyü yavaşça çıkarın.
3. ASH nöronal sağkalım testi
   1. Agaroz pedinin üzerine bir damla 20 mM sodyum azid ekleyin. 15-20 HA759 nematodlarını hareketsiz hale getirmek için damlaya aktarın.
   2. Nematodların üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin. Slaytı dijital kameralı bir floresan mikroskobu altında tutun. Nematodların baş bölgesindeki GFP pozitif ASH nöronlarını tespit etmek için 40x objektif lens ve FITC filtresi seçin.
   3. Baş bölgelerinde GFP işaretli bilateral ASH nöronlarına sahip nematodların sayısını saymak için her grupta rastgele 50'den fazla nematod seçin. ASH nöronlarının hayatta kalma oranını hesaplayın:
      Nöronal sağkalım (%) =
      Burada N_sağkalımı ve_{N toplamı}, sırasıyla GFP pozitif ASH nöronlarına sahip nematod sayısı ve her grupta test edilen toplam nematod sayısıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C. elegans suşu
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
E. coli suşu
OP50	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
reaktif
agaroz	Biyobatı	111860
Sodyum azid	Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
ekipman
48 oyuklu hücre kültürü plakası	Nest Biyoteknoloji Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Floresan mikroskobu	Guangzhou Mikro Atış Optik Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
Yüksek içerikli görüntüleme sistemi	Moleküler Cihazlar	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Mikrosantrifüj	Gen Şirketi	GENESPEED X1 IŞLEMCI DESTEĞI	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Mikroskop dijital kamera	Guangzhou Mikro Atış Optik Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
mikrodalga	Midea A.Ş.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
yazılım
Görüntü elde etme ve analiz yazılımı	Moleküler Cihazlar	MetaXpress (MetaXpress)	https://www.moleculardevices.com/ ürünleri/hücresel-görüntüleme-sistemleri/ edinim-ve-analiz-yazılımı/ metaxpress