Ozmotik Kaçınma Testi Kullanarak Transgenik Solucanlarda Kemokaçınma Davranışını İnceleyin

Abstract

Kaynak: Wang, Q. ve diğerleri, Z. Caenorhabditis elegans, Poliglutamin Aracılı Nörotoksisiteye Karşı Biyoaktif Bileşiklerin Keşfedilmesi İçin Bir Model Sistem Olarak. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, bir transgenik solucan modelinde kemokaçınma davranışını incelemek için bir ozmotik kaçınma testi açıklanmaktadır. Kaçınma davranışı, yüksek ozmotik bir bariyer ve kemoatraktan varlığında bir plakada test edilir. Fonksiyonel nöron kaybı olan solucanlar kemoatraktan tarafından çekilir, yüksek ozmotik bariyeri geçer ve anestezik çözelti nedeniyle tuzak bölgesinde felç olur.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan çözeltilerin tarifleri için Tablo 1'e bakın.

>1. Caenorhabditis elegans testi için malzemelerin hazırlanması

1. C. elegans suşlarının bakımı
   1. C. elegans (AM141 ve HA759) ve Escherichia coli (OP50 ve NA22) suşlarını elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. Nematodları, AM141 için 20 ° C'de veya HA759 için 15 ° C'de E. coli OP50 ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakasında tutun.
2. E. coli OP50 bakteri kültürünün hazırlanması
   1. Bir Luria-Bertani (LB) çizgi plakasından tek bir E. coli OP50 kolonisi seçin ve 50 mL sıvı LB kültürüne aşılayın.
   2. OP50 bakterilerini 37 °C ve 200 rpm'de bir çalkalayıcıda 570 nm'de ~0.5'lik bir optik yoğunluğa kadar inkübe edin (OD₅₇₀).
   3. OP50 bakteri kültürünü 4 °C'de saklayın ve iki hafta içinde kullanın.
3. OP50 bakterileri ile NGM plakalarının hazırlanması
   1. 1 L otoklavlanabilir bir şişeye 20 g agar, 2.5 g pepton, 3.0 g NaCl ve 975 mL deiyonize su ekleyin. 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
   2. Sıvı NGM agar şişesini ~60 °C'ye soğuması için tezgahın üzerine koyun ve ardından aşağıdaki steril stok solüsyonlarını ekleyin: 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgS04, 1 mL 5 mg/mL kolesterol ve 25 mL 1 M potasyum fosfat (pH 6.0).
   3. 20 mL NGM'yi 90 mm'lik steril bir Petri kabına dökün ve plakaları soğuması ve katılaşması için tezgahın üzerinde bırakın. Tabakları ters çevirin ve 2 gün boyunca oda sıcaklığında tezgahta kurumaya bırakın.
   4. Her bir NGM plakasına 200 μL OP50 bakteri kültürü dağıtın ve steril bir cam kaplama çubuğu ile eşit şekilde yayın. Kapakları kapatın ve plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   5. OP50 ile tohumlanmış NGM plakalarını oda sıcaklığında kapaklı plastik bir kutuda saklayın ve iki hafta içinde kullanın.
4. Yaşa senkronize C. elegans popülasyonunun hazırlanması
   1. Gravid yetişkin nematodları steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve 1 dakika boyunca 1000 × g'da santrifüjleyin. Üç kez yıkayın ve nematodları M9 tamponunda tekrar süspanse edin.
   2. Eşit hacimde çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve 3-5 dakika hafifçe çalkalayın. Ağartmayı her 15 saniyede bir diseksiyon mikroskobu altında izleyin.
      not: Ağartma çözeltisi kullanımdan önce eşit hacimlerde %10 NaOCl ve 1 M NaOH karıştırılarak taze olarak hazırlanmalıdır (Tablo 1).
   3. Nematodların çoğu parçalandıktan sonra, M9 tamponu ile seyrelterek sindirimi durdurun. Süpernatanı çıkarmak için hızlı bir şekilde santrifüjleyin ve yıkamayı üç kez tekrarlamak için peleti M9 tamponunda yeniden süspanse edin.
   4. Peleti S ortamında yeniden süspanse edin. Yumurtalar süpernatantta kalırken nematod kalıntılarının 2-3 dakika yerçekimi ile çökmesine izin verin.
   5. Süpernatanı yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aspire edin. Yumurtaları 1 dakika boyunca 1000 × g'da santrifüj ederek toplayın.
   6. Süpernatantın ~% 80'ini atın ve yumurtaları 20 mL S ortamı içeren steril bir şişeye aktarın. Şişeyi bir çalkalayıcıya yerleştirin ve senkronize L1 nematodları elde etmek için yumurtaları gece boyunca yiyeceksiz 120 rpm'de kuluçkaya yatırın.

2. PolyQ aracılı nörotoksisite testleri

1. C. elegans'ın test numuneleri ile tedavisi
   1. PoliQ nörotoksisite testi için nematodları hazırlamak için, HA759'un 300-500 senkronize L1 larvalarını, OP50 (0.7-0.8 OD570) ve 5 mg / mL astragalan içeren 500 μL S ortamı ile 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın, tipik olarak her tedavi için üç tekrar kuyucuğu.
   2. Plakayı parafilm ile kapatın ve 3 gün boyunca 15 ° C ve 120 rpm'de inkübe edin.
   3. Nematodları santrifüjleme ile toplayın ve M9 tamponu ile 3-5 kez yıkayın. Nöronal sağkalım ve kaçınma deneylerinde kullanılmak üzere M9 tamponundaki nematodları yeniden süspanse edin.
2. Ozmotik kaçınma deneyi
   1. Yiyecek içermeyen bir NGM plakasını (9 cm) ortada 8 M'lik bir gliserol (~30 μL) çizgisi ile normal (N) ve tuzak (T) bölgelerine bölün. Gliserol bariyerinden Bölge T'ye geçen nematodları felç etmek için gliserol hattından ~ 1 cm uzağa 200 mM sodyum azid (~ 20 μL) hattı yayın.
   2. Her biri için ~ 200 nematodları, her grup için üç çoğaltma plakasının N Bölgesine aktarın. Nematodları çekmek için Bölge T'ye (plaka kenarından 1 cm) bir damla% 1 bütandion (~ 2 μL) ekleyin. Petri kabının kapağını hemen kapatın ve 23 °C'de 90 dakika inkübe edin.
   3. Mikroskop altında N ve T bölgelerindeki nematod sayısını puanlayın. eq.
      kullanarak kaçınma indeksini hesaplayın Kaçınma indeksi = N / (T + N)
      Burada N ve T, sırasıyla N ve T bölgelerindeki nematodların sayısıdır. Veriler, >3 bağımsız deneyi temsil eden üç kopyanın standart sapması (SD) ± ortalaması olarak sunulmuştur.
   4. Astragalan ve kontrol gruplarından gelen verileri karşılaştırmak için eşleştirilmemiş, iki kuyruklu bir t-testi gerçekleştirin.

Tablo 1:

çözüm	Hazırlık talimatları	depolama
>1 M CaCl2	111 g CaCl2	Oda sıcaklığında (RT) saklayın
1 L'ye dH2O ekleyin
otoklav
>1 M Potasyum fosfat (pH 6.0)	108,3 g KH2PO4	RT'de saklayın
	35,6 K2HPO4
	1 L'ye dH2O ekleyin
	otoklav
>1 M MgSO4	246 g MgSO4·7H2O	RT'de mağaza
1 L'ye dH2O ekleyin
otoklav
Etanolde kolesterol (5 mg/mL)	0.5 g Kolesterol	-20 °C'de saklayın
	100 mL'ye etanol ekleyin
	Otoklav yapmayın!
>1 M Potasyum sitrat (pH 6.0)	10.0 g sitrik asit monohidrat ekleyin	RT'de saklayın
	146.75 g tri-potasyum sitrik asit monohidrat ekleyin
	1 L'ye dH2O ekleyin
	otoklav
Eser metal çözeltisi	0.93 g Disodyum EDTA	RT'de karanlıkta saklayın
	0.345 g FeSO4·7H2O
	0.1 g MnCl2·4H2O
	0.145 g ZnSO4·7H2O
	0.0125 g CuSO4·5H2O ekleyin
	500 mL'ye dH2O ekleyin
	otoklav
>1 M NaOH	4 g NaOH	RT'de Mağaza
100 mL'ye dH2O ekleyin
>Çamaşır suyu çözeltisi	0.5 mL 1 M NaOH	Kullanmadan önce taze olarak hazırlayın
	0.5 mL% 10 NaOCl
M9 arabelleği	5 g NaCl	RT'de mağaza
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	1 L'ye dH2O ekleyin
	otoklav
	1 mL 1 MMgS04 ekleyin
S bazal	5.85 g NaCl	RT'de mağaza
	6.0 g KH2PO4
	1,0 g K2HPO4
	973 mL'ye dH2O ekleyin
	Otoklav ve ~ 60 ° C'ye soğutun
	Etanole 1 mL 5 mg/mL kolesterol ekleyin
S orta	S bazal	RT'de mağaza
	3 mL 1 M CaCl2 ekleyin
	3 mL 1 MMgS04 ekleyin
	10 mL 1 M potasyum sitrat ekleyin
	10 mL eser metal çözeltisi ekleyin
	Tüm bileşenler otoklavlanmıştır, otoklav yapmayın
>5 mg/mL astragalan	0.1 g astragalan	-80 °C'de alikotlarda saklayın
	20 mL S ortamı ekleyin
	0,22 μm şırınga filtresinden süzün
200 mM sodyum azid	1,3 g NaN3	4 °C'de saklayın
	100 mL S ortamı ekleyin
>8 M Gliserol	73.67 g gliserol	RT'de Mağaza
100 mL'ye dH2O ekleyin
% 10 Bütandion stoğu	10 μL bütandion ile 90 μL dH2O karıştırın	RT'de saklayın
% 1 Bütandion	90 μL dH2O'ya 10 μL bütandion stoğu ekleyin	RT'de saklayın
1 L Luria-Bertani (LB) kültürü	10 g NaCl	RT'de Mağaza
	10 g Tripton
	5 g Maya özü
	1 L'ye dH2O ekleyin
	otoklav

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans suşları
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
E. coli suşları
NA22	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
reaktif
Ağar	Şangay EKEAR Biyo-Teknoloji Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Bütandion	Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0
kolesterol	Sigma-Aldrich	C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
Gliserol	Aladdin Co., Ltd.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
Pepton	Guangdong HuanKai Mikrobiyal Bilim ve Teknoloji Co., Ltd.	050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Sodyum azid	Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
Sodyum hidroksit	Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 D3d8c68ec25e6
Sodyum hipoklorit çözeltisi	Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Tripton	Oksoit Ltd. Şti.	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Maya özü	Oksoit Ltd. Şti.	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
ekipman
48 oyuklu hücre kültürü plakası	Nest Biyoteknoloji Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
90 mm Petri kabı	Sangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
otoklav	Panasonic Belediyesi	MLS-3781L-Bilgisayar
Diseksiyon mikroskobu	ChongQing Optik Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Mikrosantrifüj	Gen Şirketi	GENESPEED X1 IŞLEMCI DESTEĞI	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Shaker	Zhicheng A.Ş.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html