Murin Miyoblastlarının Ko-Kültürdeki Göç Kapasitesini Değerlendirmek için Yara Testi

Özet

Kaynak: Toubat, O. et al., Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalinin İn Vitro Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, murin miyoblastlarının göç kapasitesini değerlendirmek için temassız bir ko-kültür yara iyileşme testi açıklanmaktadır. Bu, in vitro olarak parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerinin sinyal gönderen ve sinyal alan bileşenlerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Protokol

1. Yara tahlili:

>(Şekil 1, testin şematik modelini özetlemektedir)

1. Protokolün bu kısmına devam etmeden önce, O9-1 hücre eklerinin ve C2C12 hücre odası kuyularının, her iki hücre de ~% 70-80 birleşim noktasına gelene kadar inkübatörde yapışmasına ve çoğalmasına izin verin. Hücreler %>90 oranında birleşerek büyürse, hücreler sadece kuyudan ayrılacağı için çizik testine devam etmeyin.
2. 1x PBS ve C2C12 ortamını 37 °C su banyosuna koyarak ısıtın.
3. Süpernatan ortamı C2C12 haznesinden iyice çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın. 1x PBS'yi çıkarın ve hücreleri hemen steril bir P10 pipet ucuyla çizin.
   1. Steril P10 pipet ucunu, hücre tek tabakasının tüm uzunluğunu veya genişliğini kapsayacak şekilde (örn. sağdan sola, yukarıdan aşağıya) tek bir yönde sıkıca geçirin. Hücreleri içeren her kuyuyu yalnızca bir kez çizdiğinizden emin olun.
      not: Çizilme sonuçlarını optimize etmek için, farklı deneysel koşullardaki kuyuları benzer bir birleşme seviyesinde çizin. Bunu yapmak için, her 4 odacıklı kuyucuğun gerekli her deneysel koşul için hücrelere sahip olduğundan emin olun (örneğin, kuyu #1 negatif kontrol, kuyu #2 pozitif kontrol). Ek olarak, her çizik için yeni bir steril P10 pipet kullanın ve her seferinde pipete benzer miktarda kuvvet uygulayın. Her kuyucukta birden fazla çizik oluşturmaya çalışmayın.
   2. Çizdikten sonra, bir P1000 pipet ucu kullanarak 1 mL 1x PBS'yi hızlı bir şekilde kuyuya geri ekleyin. Çizilecek her kuyu için bu işlemi tekrarlayın.
      not: Her çizikle ilişkili değişkenlik göz önüne alındığında, her deneysel durumda yara oluşturmak için birden fazla kuyu (n = 3) kullanılması önerilir. Bu adımlar sırasında hücrelerin 1x PBS'siz kaldığı süreyi en aza indirmek kritik olduğundan hızlı bir şekilde çalışın. Her oyuktan 1x PBS çıkarıldıktan sonra, her oyukta bir yara oluşturmak için 5 saniyeden fazla sürmemelidir.
4. Bir yara oluşturduktan ve her bir oyuğa 1x PBS ekledikten sonra, çiziği parlak alan ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görüntüleyin ve bu görüntüyü temel yara boyutu (zaman 0) olarak kullanın. Görüntü çekmek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
   1. Güç düğmesine basarak bilgisayarı ve mikroskobu açın (Malzeme Tablosuna bakın). Oda sürgüsünü sahneye yerleştirin ve objektif kadranını 5x büyütmeye çevirin.
   2. Bilgisayarın masaüstündeki yazılım simgesini çift tıklatarak görüntüleme yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Tıkla Kamera yazılım ana ekranındaki sekme. AxioCam IC sekmesindeki hücreleri görselleştirmek için Canlı düğmesine tıklayın.
   3. Işığın kameraya ve bilgisayar ekranına geçmesine izin vermek için ışık filtresinin tamamen dışarı çekildiğinden emin olun. Yara alanını AxioCam IC sekmesindeki canlı görüntünün merkezine konumlandırmak için hazne sürgüsünü manuel olarak hareket ettirin ve/veya döndürün.
   4. Görüntü çekmek için, görüntüyü içeren AxioCam IC sekmesinin yanında yeni bir sekme açmak için tuttur'a tıklayın.
   5. Bu hareketsiz görüntüyü kaydetmek için, yazılım giriş sayfasının sol üst köşesindeki dosya'ya tıklayın | Farklı kaydet | Dosya adı kutusuna dosya adını girin. Figürü Carl Zeiss image (*.czi) formatında (varsayılan ayar) kaydedin ve dosyayı masaüstüne yalnızca Zen lite 2012 yazılım programında açılabilen bir .czi dosyası olarak kaydetmek için soldaki çubuktan masaüstünü seçin.
   6. Resmi .tiff olarak kaydetmek için, dosya | farklı kaydet'i tıklatın | dosya adı kutusuna dosya adını girin. Şekli etiketli görüntü dosyası (*.tiff) olarak kaydetmek için kayıt türü düğmesine tıklayın ve açılır menüden *.tiff seçin.
      not: .tiff formatı herhangi bir görüntü işleme yazılımında açılabilir.
   7. Aynı kuyucukta yaranın diğer noktalarında 2-3 görüntü daha almak için hazne sürgüsünü manuel olarak yeniden konumlandırın.
      not: Toplamda, bu, her bir oyukta yaranın 3-4 örtüşmeyen, yüksek büyütmeli görüntüsü ile sonuçlanacaktır.
5. Her kuyucuktan 1x PBS'yi çıkarın ve 1 mL C2C12 medium.
   ekleyin not: Yara oluşumunu takiben hazneyi iyi bir şekilde çıkarırken veya solüsyon eklerken çok agresif bir şekilde pipetlememeye dikkat edin, çünkü bu, hücrelerin hazneden iyi bir şekilde ayrılmasına neden olabilir. Ek olarak, hücre tek tabakasının bozulmasını en aza indirmek için her bir oyuğun köşelerinde çözeltilerin aspirasyonu ve yeniden yerleştirilmesi için odayı iyi eğin.
6. O9-1 hücrelerini içeren ekleri hazne kuyusunun her bir kuyusuna manuel olarak yerleştirerek kuyu ekleme kokültür sistemini monte edin. Kesici uçları, alt kısmı alttaki C2C12 hücrelerinin hemen üzerine oturacak şekilde yavaşça kuyuya doğru itin. Kuyu ekleme yapılarını inkübatöre geri koyun.
   not: Ek parçanın alt kısmının, alttaki C2C12 hücrelerine fiziksel olarak temas etmesine ve mekanik olarak bozmasına izin vermeyin.
7. Hücrelerin toplam 9-12 saat göç etmesine izin verin. En uygun göç süresini belirlemek için, hücreleri yara oluşumundan 6 saat sonra, daha sonra her 2-3 saatte bir kontrol edin. Kontrol veya pozitif kontrol koşullarındaki hücreler yarayı tamamen kaplamaya başladığında deneyi sonlandırın.
   not: Yapının temassız doğası göz önüne alındığında, aralıklı migrasyon ilerlemesini kontrol ederken üstteki kesici ucun kuyucuklardan çıkarılmasına gerek yoktur. Bu tahlilde kullanılan hücre tipleri, yara oluşumu sırasındaki hücresel yoğunluk, oluşturulan yaranın genişliği ve manipüle edilmiş hücrelerin deneysel koşulları (örneğin, gen yıkımı, rekombinant protein ilavesi) gibi faktörlere bağlı olarak göç değişkenliği gözlenecektir. Bu reaktiflerin konsantrasyonları, üretici tavsiyelerinin rehberliğinde deneysel olarak belirlenmelidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Testin şematik modeli.Adım 1, STO besleyici hücreleri kullanılarak C2C12 miyoblastlarının ve NCC'lerin in vitro genişlemesini içerir. Adım 2, kokültür sistemindeki NCC'lerin ve C2C12 hücrelerinin kaplanmasını içerir. Adım 3, hücresel göç kapasitesini değerlendirmek için altta yatan C2C12 hücrelerinde gerçekleştirilen yara testini içerir. Adım 4, göç eden hücrelerin sitolojik mimarisi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C2C12 murin miyoblast hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1772
Hazneli Kızak Sistemi, 4 kuyulu	ThermoFisher Bilimsel	154526
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), yüksek glikoz (4.5 g / L), Lglutamin (2 mM)	Corning	10-017-Özgeçmiş	4 °C'de saklanır
Dereceli ve steril pipet uçları, 10 μL	ABD Bilimsel	1111-3810
O9-1 nöral krest hücre hattı	Kırlangıç Sigma	SCC049
Fosfat tampon salin (PBS), 1x, kalsiyum ve magnezyum olmadan, pH 7.4	Corning	21-040-Özgeçmiş	4 °C'de saklanır
0,4 μM şeffaf PET membranlı 24 oyuklu plaka için falcon geçirgen destek	Corning	353095
Fetal sığır serumu	Balıkçı Bilimsel	W3381E	-20 ° C'de 50 mL alikotlarda saklanır
Zeiss ters çevrilmiş Axio Vert.A1 ışık mikroskobu	Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 mikroskopi yazılımı	Carl Zeiss AG		Görüntüleme yazılımı

Serisi Serisi Serisi