Kimyasal Olarak Bağlanmış Antikor-Antijen Konjugatlarını Doğrulamak için Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi

Özet

Kaynak: Volckmar, J. et al., Fare Dendritik Hücrelerini In Vitro ve In Vivo Hedeflemek için Tam Uzunlukta Protein ile Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, sandviç enzime bağlı immünosorbent testi veya ELISA tekniği ile kimyasal olarak konjuge antikor-antijen komplekslerinin tespitini göstermektedir. Yakalanan antikor, antikor-antijen konjugatının antijeninin spesifik epitopuna bağlanır ve daha sonra enzime bağlı bir ikincil antikor kullanılarak görselleştirilebilir.

Protokol

1. Hibridoma hücre hattı NLDC-145'ten αDEC-205 üretimi

1. Antikor üretimi için, bir su banyosunda 37 ° C'de αDEC-205 üreten dondurularak saklanmış NLDC-145 hücrelerini çözün. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO_2'de genişletin. Antikor üretimine devam etmek için iki adet 75^cm2 şişeye ihtiyaç duyulacaktır. Hücre kültürü prosedürleri, güvenli çalışma koşullarını sağlamak ve kültürlerin kontaminasyonunu önlemek için bir güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
   1. % 1 penisilin / streptomisin (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 9 mL ISF-1 ortamında 1 mL çözülmüş hücreleri (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ hücre / mL) bir hücre kültürü şişesine (25^cm2) yeniden süspanse edin. Şişeyi yatay olarak 37 °C, %5 CO_2'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
   2. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO_2'de,% 70 birleşene kadar kültürleyin. Bu normalde 24 - 48 saat sonra elde edilmelidir.
   3. Hücreler %70 birleştiğinde, NLDC-145 hücre süspansiyonunun tamamını (10 mL), 1-10 mL hacim aralığında bir pipete sahip bir pipet kontrolörü kullanarak 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
   4. ISF-1 ortamını bir su banyosunda 37 °C'ye önceden ısıtın ve peleti %1 penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş 12 mL ISF-1 ortamında yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse hücre süspansiyonunu taze bir hücre kültürü şişesine (75^cm2) aktarın.
   5. 37 ° C'de% 1 penisilin / streptomisin ve% 5 CO₂ ile desteklenmiş ISF-1 ortamındaki hücreleri,% 70 birleşen ve% 99 canlı olana kadar kültürleyin ve genişletin. Bu normalde 48 - 72 saat sonra elde edilmelidir.
   6. Hücreleri 75 cm'lik² şişeye bölün. Bunu yapmak için, önce tüm NLDC-145 hücrelerini yüzeyden çıkarmak için hücre kültürü şişesi tabanını/kültür yüzeyini hücre süspansiyonu ile yıkayın. 6 mL NLDC-145 hücre süspansiyonunun her birini iki taze 75^cm2 şişeden birine aktarın ve 12 mL'ye kadar% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş önceden ısıtılmış ISF-1 ortamını ekleyin.
      not: NLDC-145 hücreleri ortamı şartlandırmış olacağından hücre kültürü ortamını yenilemeyin. Hücreleri ortamlarıyla birlikte aktarın ve kültürü istenen hacme kadar taze ortamla doldurun. Bu, NLDC-145 hücreleri tarafından canlılık ve maksimum antikor üretimi için çok önemlidir.
   7. Hücre kültürlerini 37 ° C ve% 5 CO_2'de, genellikle 48 - 72 saat sonra elde edilen yaklaşık% 70 birleşene kadar genişletin.
   8. Hücreler% 70 birleştiğinde, 75 cm'lik 2 şişelerin her birinden 10 mL genişletilmiş NLDC-145 hücre süspansiyonunu bir PETG (polietilen tereftalat glikol) silindir şişeye (1,050^cm2) aktarın. Bunun için, bir pipet kontrolörü ve 10 mL pipet kullanarak tüm hücreleri yüzeyden çıkarmak için hücre kültürü şişesi tabanını/kültür yüzeyini hücre süspansiyonu ile yıkayın.
   9. %1 penisilin / streptomisin (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 140 mL ISF-1 besiyerini doğrudan orta şişeden NLDC-145 içeren rulo şişelerin her birine ekleyin ve bunları 150 mL işaretine kadar doldurun.
      not: Adım 1.1.6'daki nota bakın.
   10. Silindir şişeleri üç gün boyunca 37 °C, %5 CO₂ ve 25 tur / dk'da kültürleyin.
   11. %1 penisilin / streptomisin (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 150 mL ISF-1 ortamı ekleyin ve bunları 300 mL işaretine kadar doldurun.
   12. Her biri 300 °C, %37 CO, 5 ve 25 tur / dk'da 25 mL kültür içeren silindir şişeleri üç gün daha kültürleyin.
   13. NLDC-145 içeren silindir şişelerin her birine %1 penisilin / streptomisin (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 100 mL daha ISF-1 ortamı ekleyin, böylece bunları 400 mL işaretine kadar doldurun.
   14. Her biri 37 ° C,% 5 CO₂ ve 25 tur / dk'da 400 mL kültür içeren silindir şişeleri yedi gün daha kültürleyin.
       not: Bu hafta boyunca, kültür çok yoğunlaşır (% 95'e kadar yoğunluk) ve canlılık azalır (% 50'ye kadar düşer), bu da maksimum antikor salınımını sağlar.
2. αDEC-205'in kültür süpernatantından saflaştırılması için, NLDC-145 hücre süspansiyonunu (her iki silindirli şişeden) doğrudan 500 mL otoklavlanmış santrifüj şişelerine dökün.
   not: Toplam hacim 800 mL kültür toplanmalıdır.
   1. Hücreleri ve kalıntıları temizlemek için kültürü 8.600 x g ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanları toplayın, peletleri atın ve süpernatanları steril bir reaktif şişesinde toplayın.
      not: αDEC-205'in saflaştırılmasına hemen başlanabilir (aşama 2.) veya süpernatan 4 °C'de kısa süreli olarak saklanabilir.

2. αDEC-205 antikorunun NLDC-145 hücre süpernatantından saflaştırılması

NOT: NLDC-145 hücre süpernatantından αDEC-205, bir protein G Sefaroz sütunu (yeniden kullanılabilir) kullanılarak saflaştırılır. Kolon ölçüleri 15 mm x 74 mm olup, kolon başına 5 mL protein G Sefaroz paketlenmiştir.

1. Protein G Sepharose kolonunun hazırlanması ve yıkanması için, protein G Sepharose kolonunun üst açıklığına hava geçirmez bir lastik tapa koyun. Lastik tapayı iki steril kanül (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm) ile delin.
   1. İki kanülden birine 10 mL'lik bir şırınga ve ikinci kanüle bir boru konektörü olan esnek bir silikon tüp (yaklaşık 100 cm uzunluğunda, 2,5 - 3 mm çapında) bağlayın.
      not: Şırınga / kauçuk tıkaç yapısı tekrar kullanılabilir ve büyük hacimli kültür süpernatanının protein G Sefaroz kolonuna sürekli akışı ile sonuçlanan bir vakum sağlar. Bu amaçla, aşağıdaki adımlarda sürekli sıvı akışını sağlamak için şırınganın pistonunu hafifçe geri çekin.
   2. Önceki herhangi bir antikor saflaştırmasından potansiyel olarak kalan antikoru çıkarmak için kolonu 50 mL 0.1 M buzlu asetik asit (pH 2) ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu 0.1 M buzlu asetik asit (pH 2) dolgulu reaktif şişesine koyun. İndüklenen vakumun bir sonucu olarak, 50 mL 0.1 M buzlu asetik asit (pH 2) protein G Sefaroz kolonundan damla damla geçer.
      NOT: 0.1 M buzlu asetik asit (pH 2) bir reaktif şişesinde saklanmalı veya bir behere taze olarak doldurulmalıdır.
   3. Kolonu 100-200 mL fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu PBS dolgulu bir reaktif şişesine veya kabına koyun. 100-200 mL PBS'nin protein G Sefaroz kolonundan damla damla geçmesine izin verin.
2. NLDC-145 süpernatantından antikor saflaştırması için, kolona 800 mL NLDC-145 süpernatanı (adım 1.2.2'den elde edilir) yükleyin. Silikon tüpün ucunu NLDC-145 süpernatan dolgulu reaktif şişesine koyun. 800 mL NLDC-145 süpernatantının kolon boyunca damla damla akmasına izin verin.
   1. Kolonu 500 mL PBS ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu PBS dolgulu bir reaktif şişesine veya kabına koyun. 500 mL PBS'nin kolon boyunca damla damla çalışmasına izin verin.
   2. Elüsyon için 20 adet 1,5 mL tüp kullanın ve her 1,5 mL'lik tüpe 100 μL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) pipetleyin. Lastik tapayı kolondan çıkarın ve antikoru kolondan çıkarmak için 1 mL 0.1 M glisin (pH 3) protein G Sefaroz kolonunun üst odasına pipetleyin. Akışı doğrudan hazırlanan 1,5 mL'lik tüplerden birinde elüat olarak toplayın.
   3. 20 tüpün tümü (1,5 mL) için elüsyon adımını (2.2.2.) tekrarlayın.
   4. Antikor içeren fraksiyonları tanımlamak için bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de (OD₂₈₀) tüm elüsyon fraksiyonlarının optik yoğunluğunu belirleyin.
      not: İlk elüsyon fraksiyonunu boş olarak kullanın.
   5. Tüm kesirleri 0,5'ten büyük bir OD₂₈₀ ile birleştirin (yaklaşık 10 kesir).
   6. % 20 etanol ile doldurulmuş protein G Sefaroz kolonunu 4 ° C'de saklayın.
3. 12 - 14 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme (MWCO) ile diyaliz tüpü kullanarak gece boyunca 4 ° C'de 1000 mL PBS'ye (2000 mL'lik bir beherde) karşı havuzlanmış elutiyonları diyaliz edin.
   1. Diyaliz tüpünü 20 cm'lik parçalar halinde kesin. Diyaliz tüpünü 500-800 mL 10 mM EDTA'da (pH 7.5) 30 dakika boyunca kontaminasyonu gidermek için sıcak bir plaka kullanarak bir beherde kaynatın. 10 mM EDTA (pH 7.5) çözeltisini atın ve diyaliz tüpünü deiyonize suda 10 dakika
      kaynatın not: Diyaliz tüpü doğrudan kullanılabilir veya% 0.01 sodyum azid (NaN₃) / H₂O çözeltisi içinde 4 ° C'de bir sonraki kullanıma kadar saklanabilir.
   2. Diyaliz tüpünün altını uygun bir diyaliz tüpü kapatma/tek parça, menteşeli kelepçe ile kapatın ve antikor elüsyonunu dikkatlice diyaliz tüpüne pipetleyin. Diyaliz tüpünün üst kısmını ikinci bir kelepçe ile kapatın.
   3. Diyaliz tüpünün üst kelepçesini yüzer bir standa sabitleyin, manyetik bir karıştırma çubuğu ile birlikte PBS dolgulu behere yerleştirin ve beheri manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin.
   4. Gece boyunca 4 °C'de karıştırarak diyalize edin.
4. αDEC-205 konsantrasyonunu artırmak için, tüm diyalizatı 10 kDa MWCO'lu bir santrifüj yoğunlaştırıcıya yükleyin. Borunun bir kelepçesini açın ve diyaliz borusundan tüm diyalizatı santrifüj yoğunlaştırıcıya (10 kDa MWCO) dikkatlice pipetleyin.
   not: Pipet ucuyla yoğunlaştırıcının altına dokunmayın.
   1. 693 x g (2.000 rpm) ve 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
   2. Santrifüj yoğunlaştırıcıyı 10 mL PBS ile yükleyin ve 693 x g (2.000 rpm) ve 4 ° C'de, kalan son antikor çözeltisi hacmi 1-1.5 mL.
      olana kadar santrifüjleyin not: Gerekirse, 2.4.1'deki santrifüjleme adımını tekrarlayın. İstenilen miktara ayarlamak için.
   3. Bir spektrofotometre kullanarak, konsantre αDEC-205 çözeltisinin optik yoğunluğunu 280 nm'de (OD₂₈₀) belirleyin. PBS'yi boş olarak kullanın.
   4. Aşağıdaki formülü kullanarak αDEC-205 konsantrasyonunu hesaplayın:
      konsantrasyon [mg / mL] = OD₂₈₀ / 1.4.
   5. αDEC-205 çözeltisini 0,22 μm şırınga filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
      not: αDEC-205'in NLDC-145 hibridoma hücre süpernatantından saflaştırılması da FPLC (hızlı protein sıvı kromatografisi) ile sağlanabilir. Saflaştırılmış αDEC-205, uzun süreli depolama için 4 °C'de veya -18 °C'de saklanabilir.

3. OVA'nın αDEC-205'e kimyasal konjugasyonu

NOT: Optimal kimyasal konjugasyon için 0,5 mg OVA proteini ila 2,5 mg αDEC-205 (1:5) oranı gereklidir. Bununla birlikte, bu oran diğer proteinler ve antikorlar için değişebilir ve alternatif konjugatlar için optimize edilmesi gerekir. OVA proteininin disülfid bağlarının indirgenmesi, kimyasal konjugasyon için sülfhidril gruplarını αDEC-205'e maruz bırakan 30 mM TCEP-HCl ile inkübasyon yoluyla gerçekleştirilir ve adım 3.2'de 240 μl TCEP-HCl'ye ihtiyaç vardır. Her iki adım, TCEP ile indüklenen OVA'nın azaltılması (adım 3.1.) ve αDEC-205'in sülfo-SMCC aktivasyonu (adım 3.2.) tercihen paralel olarak gerçekleştirilmelidir.

1. Taze olarak 125 mM TCEP-HCl çözeltisi (pH 7.0) hazırlayın. İstenilen TCEP-HCl miktarını tartın ve TCEP-HCl'yi 0.9 M Tris bazında (pH 8.8) çözün. 125 mM TCEP-HCl çözeltisinin (nötr olması gereken) pH'ını test etmek için pH indikatör şeritleri kullanın ve pH'ı Tris bazı (pH 8.8) ile ayarlayın.
   1. 200 μL OVA protein solüsyonunu (0.5 mg OVA içeren) 1.5 mL steril bir tüpe pipetleyin. 0,5 mg/mL OVA proteini ve 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl) nihai konsantrasyonuna kadar bir pipet kullanarak OVA proteinine 240 μl, 125 mM TCEP-HCl ve 560 μL steril ultra saf su ekleyin.
      NOT: 2.5 mg EndoGrade OVA (liyofilize), 1 mL PBS'de çözülür ve 2.5 mg / mL OVA çözeltisi ile sonuçlanır.
   2. Elde edilen OVA / TCEP-HCl'yi oda sıcaklığında 1.5 h.
      inkübe edin not: Bu inkübasyon adımını uzatmayın.
2. Konjugasyon için αDEC-205'i aktive etmek için, 2 mg sulfo-SMCC'yi 100 μL ultra saf suda çözün.
   not: Sülfo-SMCC hidrolize karşı hassastır. Bu nedenle, daha büyük miktarlarda çözünmemiş sülfo-SMCC hızlı bir şekilde ele alınmalı veya mevcut 2 mg alikotlar kullanılmalıdır.
   1. αDEC-205'i PBS'de seyreltin, böylece 900 μL'de 2.5 mg bulunur.
   2. 1.5 mL'lik bir tüpte 2.5 mg αDEC-205 (900 μL hacim; adım 3.2.1'den elde edilir.) ve 100 μL sülfo-SMCC'yi (adım 3.2'den elde edilir.) karıştırın, böylece toplam hacim 1 mL'dir.
   3. αDEC-205/sulfo-SMCC çözeltisini bir ısıtma bloğunda 37 °C ve 550 rpm'de 30 dakika inkübe edin.
3. Bu inkübasyonları takiben, fazla sülfo-SMCC ve TCEP-HCl, tuzdan arındırma kolonları (MWCO 7 kDa; 5 mL kolon hacmi) kullanılarak çözeltilerden hemen uzaklaştırılır.
   1. Kolonların (MWCO 7 kDa) alt kapağını çevirin, kapağı gevşetin ve kolonu 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
   2. Sıvıyı çıkarmak için oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   3. Sütunu yeni bir tüpe yerleştirin ve kapağı çıkarın. Sırasıyla antikor/sülfo-SMCC ve OVA/TCEP-HCl'yi her biri bir kolondan oluşan kompakt reçine yatağının merkezine yavaşça yükleyin.
   4. Oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   5. Kullandıktan sonra sütunları atın. Konjugasyon için hazırlanmış antikor ve OVA içeren çözeltiler tüplerin içindedir.
   6. αDEC-205 ve OVA konjugasyonu için pipetleme yaparak her iki çözeltiyi de hemen karıştırın.
   7. Elde edilen αDEC-205 ve OVA karışımını gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
4. Konjugasyonu takiben, fazla bağlanmamış OVA çözeltiden çıkarılır ve birleştirilmiş αDEC-205/OVA, bir santrifüjlü protein yoğunlaştırıcı (MWCO 150 kDa) kullanılarak konsantre edilir.
   1. Santrifüjlü protein yoğunlaştırıcıyı (MWCO 150 kDa) kolon üzerine 12 mL PBS pipetleyerek ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyerek önceden durulayın.
      not: Gerekirse, kolondan yaklaşık 5 mL'lik bir hacim geçene kadar santrifüjleme adımını (3.4.1.) tekrarlayın.
   2. αDEC-205/OVA'yı santrifüjlü protein yoğunlaştırıcıya yüklemeden önce, western blot analizi için 20 μL'lik konsantre edilmemiş αDEC-205/OVA örneğini saklayın. Bu alikotu analize kadar 4 °C'de saklayın.
   3. αDEC-205/OVA'yı pipetleme ile santrifüj protein yoğunlaştırıcıya yükleyin.
      not: Santrifüj yoğunlaştırıcının üst odasının yatağı ile herhangi bir temastan kaçının.
   4. Yoğunlaştırıcıyı PBS ile 15 mL'ye kadar doldurun ve yoğunlaştırıcıyı oda sıcaklığında 2.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   5. Western blot analizi için akış örneğinin (akış I) bir örneğini kaydedin ve kalan akışı atın.
   6. Yoğunlaştırıcıyı PBS ile 10 mL'ye kadar doldurun ve yoğunlaştırıcıyı oda sıcaklığında 8 x g'da en az 2,000 dakika santrifüjleyin.
   7. Western blot analizi için ikinci akış (akış II) için bir örnek kaydedin ve kalan akışı atın.
   8. İstenen zenginleştirme elde edildiğinde (αDEC-205/OVA çözeltisinin yaklaşık 1,5 mL'si üst haznede bırakılmalıdır) konsantre numuneyi nazikçe aspire edin.
      not: Üst haznede çok fazla sıvı kalırsa, santrifüjleme tekrarlanabilir ancak mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır.
5. Elde edilen αDEC-205/OVA'nın protein konsantrasyonunu bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak belirleyin. PBS'yi boş olarak kullanın.
6. αDEC-205/OVA'yı 0,22 μm şırınga filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
   not: Daha sonraki analizler ve in vivo deneyler için αDEC-205/OVA, 4 °C veya -18 °C'de saklanabilir.

4. Kimyasal konjugasyonun ELISA ile doğrulanması

1. αDEC-205/OVA ile sonuçlanan başarılı kimyasal konjugasyonun daha fazla doğrulanması için ELISA gerçekleştirin.
2. Kaplama tamponunda (0.1 M sodyum bikarbonat (NaHCO₃) pH 9.6, H₂O içinde seyreltilmiş) 100 μL / oyuklu 3 ng / μL tavşan αOVA antikoru ile uygun bir 96 oyuklu ELISA plakasını kaplayın.
   1. Plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
3. Kaplamayı takiben, plakayı PBS ile üç kez, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak yıkayın.
4. Plakanın her bir oyuğuna 200 μL bloke edici tampon (PBS'de %10 FCS) pipetleyerek plakayı bloke edin ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
5. 6 μg/mL ile 93.8 ng/mL αDEC-205/OVA arasında değişen seyreltmeler elde etmek için αDEC-205/OVA'yı (adım 3.6'dan elde edilir.) 1:2 oranında bloke edici tamponda (PBS'de %10 FCS) seri olarak seyreltin ve bu azalan miktarlarda αDEC-205/OVA'dan 100 μL/kuyucuk ekleyin.
   1. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
6. Plakayı PBS ile üç kez yıkayın, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak.
7. Plakanın her bir oyuğuna 100 μL keçi αrat-IgG + IgM (H + L) -HRPO antikoru (bloke edici tamponda 1: 2.000'e seyreltilmiş (PBS'de% 10 FCS)) ekleyin.
   1. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
8. Plakayı PBS kullanarak, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
9. Kuyucuklara 50 μL HRPO-substrat ekleyin. Berrak bir renk reaksiyonu gözlemlerken, kuyucuk başına 150 μl durdurma çözeltisi (1M H_2S04) ekleyerek reaksiyonu durdurun.
10. 5 dakika sonra, bir ELISA okuyucu kullanarak 450 nm'de emilimi okuyun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Engelleme tamponu (ELISA)			PBS'de %10 FBS
Hücre kültürü şişesi T25	Greiner Bio-Bir	690175	standart CELLSTAR filtre kapağı hücre kültürü şişeleri kullanıyoruz; alternatif olarak süspansiyon kültürü şişesi (690195 ) kullanın
Hücre kültürü şişesi T75	Greiner Bio-Bir	658175	standart CELLSTAR filtre kapağı hücre kültürü şişeleri kullanıyoruz; alternatif olarak süspansiyon kültürü şişesi (658195) kullanın
Hücre kültürü şişesi T175	Greiner Bio-Bir	661175	standart CELLSTAR filtre kapağı hücre kültürü şişeleri kullanıyoruz; alternatif olarak süspansiyon kültürü şişesi (661195) kullanın
Santrifüj yoğunlaştırıcı MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 santrifüj yoğunlaştırıcı
Santrifüj protein yoğunlaştırıcı MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Bilimsel	88532	Pierce Protein Konsantratör, PES 5 -20 ml; Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL'yi (katalog numarası 89921) kullanıyoruz, ancak artık mevcut değil
Santrifüj şişeleri	Nalgene Belediyesi	525-2314	PP (polipropilen) vidalı kapaklı PPCO (polipropilen kopolimer), 500 ml; VWR, Almanya'dan elde edildi
Kaplama tamponu (ELISA)			H2O (pH 9.6) içinde 0.1 M sodyum bikarbonat (NaHCO3)
Tuzdan arındırma kolonları MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Bilimsel	89891	Thermo Scientific Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 5 mL
Algılama reaktifi ELISA (HRPO substratı)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3",5,5" -Tetrametilbenzidin (TMB) sıvı substrat sistemi
ELISA 96 oyuklu plaka	Thermo Fisher Bilimsel	442404	MaxiSorp Nunc-İmmüno Plakası
Fetal baldır serumu	PAN-BİYO TEKNOLOJİSİ	P40-47500	FBS İyi forte
İDF-1 orta	Biyokrom / biyoswisstec	F 9061-01
NLDC-145 hibridoma	ATCC (Uzay Servisi)	HB-290	Henüz elde değilse, hibridoma hücreleri ATCC'den elde edilebilir
Yumurta albümü	Hyglos (BioVendor aracılığıyla)	321000	<0.1 EU/mg ile EndoGrade OVA ultra
Penisilin / Streptomisin	Thermo Fisher Bilimsel	15140122	Gibco Penisilin / Streptomisin 10.000 U / ml; alternatif olarak Gibco Penisilin / Streptomisin 5.000 U / ml (15070-063) kullanılabilir
PETG polietilen tereftalat glikol hücre kültürü rulo şişeleri	Nunc In Vitro	734-2394	standart PDL kaplı, havalandırmalı (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml hacim; VWR, Almanya'dan elde edilmiştir
pH indikatör şeritleri	Merck	109535	pH indikatör şeritleri 0-14
Poliklonal keçi αrat-IgG+IgM-HRPO antikoru (ELISA)	Jackson İmmün Araştırma	112-035-068	Dianova, Almanya'dan elde edildi; ELISA için 1:2000'de kullanıldı
Poliklonal tavşan αOVA (ELISA)	Abcam Belediyesi	ab181688	3 ng/μL'de kullanılır
Protein G Sefaroz sütunu	Merck/Kırlangıç	P3296 Serisi	5 ml Protein G Sefaroz, Hızlı Akış boş bir PD-10 sütununa paketlenir (Merck, GE 17-0435-01)
Lastik tapa	Çok Amaçlı Laboratuvar	5230217	DEUTSCH & NEUMANN kauçuk tıpalar (alt Φ 17 mm; üst Φ 22 mm)
Silikon tüp	Çok Amaçlı Laboratuvar	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (iç Φ 1 mm; dış Φ 3 mm)
İnce-Hızlı			Eczanede ücretsiz olarak bulunan normal Slim-Fast Çikolata'yı kullandık, çünkü bu western blot yaklaşımında süt tozundan daha iyi sonuçlar verdi
Durdurma çözümü (ELISA)			1 milyon H2SO4
Sülfo-SMCC	Thermo Fisher Bilimsel	22322	Pierce Sulfo-SMCC Çapraz Bağlayıcı; alternatif olarak katalog numarası A39268 (10 x 2 mg) kullanın
Şırınga filtre ünitesi 0.22 μm	Merck/Kırlangıç	SLGV033RS	Millex-GV Şırınga Filtre Ünitesi, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, gama sterilize
Şırınga 10 ml	Çok Amaçlı Laboratuvar		Tek kullanımlık şırıngalar Injekt® Solo B.Braun
Sterican® kanülleri	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2 inç; 0,90 x 40 mm; sarı
TCEP-HCl	Thermo Fisher Bilimsel	A35349
Boru konektörü	Çok Amaçlı Laboratuvar		Silikon tüp için Kleinfeld minyatür boru konektörleri

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi saf (İngilizce) Serisi