Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Özet

Kaynak: Ji, Y., et al. Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı. J. Vis. Uzm. (2022).

Video, zararlı ajanlara maruz kaldıktan sonra DNA hasarını tespit etmek için kuyruklu yıldız testini göstermektedir. Alkali koşullar altında, DNA gevşer ve denatüre olur ve elektroforez üzerine, hasar görmemiş ve hasar görmüş DNA, agaroz jeli içinde farklı şekilde göç ederek kuyruklu yıldız şeklinde bir yapı oluşturur. Yavaş göç eden hasarsız DNA, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluştururken, hızla göç eden hasarlı DNA parçaları, uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturur.

Protokol

1. Kuyruklu yıldız tahlili için malzemelerin hazırlanması

1. Mikroskop lamlarının hazırlanması
   1. %1 (a/h) normal erime noktalı agarozu [çift damıtılmış suda (ddH₂O)] 50 mL'lik bir tüpe dökün ve agarozu ddH₂O'da çözmek için mikrodalgada pişirin. Katılaşma meydana gelirse, atın ve taze olarak hazırlayın.
   2. Mikroskop slaytlarını, slaytları %1 (a/h) normal erime noktalı agaroz içeren 50 mL'lik tüpe daldırarak ön kaplama
   .
   3. Slaytları daldırdıktan sonra slaytların arkasını hızlı bir şekilde silin.
      not: Slaytların arkasının düzgün bir şekilde silinmemesi, mikroskopla yapılan analiz adımı sırasında slaytların arka plan gürültüsünü artıracaktır.
   4. Kaplanmış slaytı, buzlu bölümün sağ alt köşesinde kalıcı bir işaretleyici ile etiketleyin (Şekil 1A). Bu, sürgünün hangi tarafının önceden kaplandığını gösterir.
   5. Agarozun gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına ve kurumasına izin verin.
   6. Kurumuş slaytları kağıt mendile sarın ve bir kutuda saklayın.

2. Numunelerin hazırlanması

1. Kültürlenmiş hücreler
   not: İlk olarak, kuyruklu yıldız testine başlamadan önce hücreleri zararlı ajan (lar) ile tedavi edin. Ardından, aşağıdakileri gerçekleştirin.
   1. Hücreler yapışıksa, hücrelerin uygun birleştiği yerde hücre kültürü şişesinden veya hücre kültürü Petri kaplarından serbest bırakmak için hücreleri tripsinize edin. Serum içeren ortam ekleyerek tripsini nötralize edin.
   2. Hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın, santrifüjleyin (örneğin, HaCaT'ler için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin), süpernatanı nazikçe çıkarın ve hücre peletine 1 mL PBS ekleyin.
   3. Hücre sayımı gerçekleştirin.
   4. 30.000 hücreyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7.607 x g'da santrifüjleyin.
   5. Kuyruklu yıldız tahlilini gerçekleştirmeden önce süpernatanı nazikçe çıkarın ve hücre peletini karanlıkta buz üzerinde saklayın.
      not: Hücreler, diğer etkilerin yanı sıra, bildirildiği gibi, artefakt DNA hasarının oluşumunu ve değiştirilmiş DNA hasar tepkisini önlemek için kuyruklu yıldız testini gerçekleştirmeden önce Mikoplazma kontaminasyonu açısından düzenli olarak test edilmelidir. Santrifüjleme koşulları, kullanılan hücre tipine bağlı olarak gerektiği gibi değiştirilebilir.
2. Onarım testi için kültürlenmiş hücrelerin hazırlanması
   1. Hücre kültürü şişesi veya Petri kaplarındaki kültür hücreleri.
   2. Hücreleri zarar verici maddelerle tedavi etmeden önce hücreleri iki kez 1 mL PBS ile yıkayın (ör., BE-M17 hücreleri için, tedavi sırasında onarımın meydana gelmesini önlemek için buz üzerinde 20 dakika boyunca 50 μM H₂O₂ ile muamele edin).
   3. Kalan zararlı maddeleri çıkarmak için hücreleri 1 mL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
   4. Hücre kültürü ortamını yeniden ekleyin ve hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO₂) değişen sürelerde (örneğin, 0 dakika, 30 dakika, 2 saat, 6 saat, 24 saat ve 30 saat) onarılmasına izin verin.
   5. Her zaman noktasında, %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren hücre kültürü ortamında 30.000 hücre toplayın ve bunları -80 °C'de saklayın.
   6. Kuyruklu yıldız tahlilini gerçekleştirmeden önce, hücreleri bir su banyosunda 37 °C'de hızlı bir şekilde çözün ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 7.607 x g'da santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı çıkarın ve testi gerçekleştirmeden önce hücre peletini buz üzerinde saklayın (yani, 3. adımdan itibaren).

3. Hücre parçalanması

NOT: Tüm işlemleri buz üzerinde gerçekleştirin.

1. Jel başına 12.000 hücre veya 2,5 μL tam kan kullanın.
2. Bir mikrodalga kullanarak PBS'de çözülmüş %0,6 (a/h) düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve katılaşmasını önlemek için 37 °C'de bir su banyosuna koyun.
3. Önceden kaplanmış slaytların buzlu ucunu kalıcı bir işaretleyici veya kurşun kalem kullanarak araştırmacının adı, tarihi ve tedavi bilgileriyle etiketleyin.
4. Düz bir tezgah üzerine bir soğutma plakası yerleştirin ve iki donmuş soğutma paketini metal yüzeyin altındaki sürgülü çekmeceye yerleştirin (Şekil 2'de gösterildiği gibi).
5. Slaytları soğutma plakasına yerleştirin ve %0,6 (a/h) düşük erime noktalı agaroz içeren hücreleri eklemeden önce slaytların 1-2 dakika önceden soğumasına izin verin.
   not: Slaytları soğutma plakası üzerinde 1-2 dakikadan fazla bırakmak, ortam nemi nedeniyle slayt yüzeyinde yoğuşma oluşmasına neden olabilir. Bu, düşük erime noktalı agaroz jelleri slaytlar üzerinde daha az stabil hale getirebilir.
6. Peletleri (adım 2.2.7) girdap yaparak dağıtın. Tüm süpernatantın peletten çıkarıldığından emin olun. Numune tüplerini (peletlenmiş hücreleri içeren) hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin.
   not: Numune içeren tüpleri santrifüje yerleştirirken, pelet tüpün bu tarafında toplanacak şekilde menteşe dışa bakacak şekilde yerleştirin. Bazen peleti görmek zordur ve süpernatanı çıkarırken yerinden çıkarmak kolaydır. Tüp kapağı ile bu yönde santrifüj yapılması, hücre peletinin nerede olacağının bilinmesini sağlayacaktır.
7. Hücre peletini 200 μL %0,6 düşük erime noktalı agaroz (LMP agaroz) ile yeniden süspanse edin ve kabarcık oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, 80 μL LMP agaroz içeren hücreleri hızlı bir şekilde soğutulmuş bir lam üzerine aktarın ve jelin üzerine hızlı bir şekilde bir lamel yerleştirin.
8. Jelinin soğutma plakasında 1-2 dakika sertleşmesine izin verin.
9. Bu arada, 500 mL'lik bir çalışma çözeltisi lizis tamponu hazırlayın (Tablo 1) ve lizis kabına dökün (Şekil 3).
10. Jeller ayarlandıktan sonra, lameti başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe tutarak ve lamel jelden kaydırarak lamelleri hızlı bir şekilde çıkarın.
11. Numuneleri içeren slaytları slayt taşıyıcının içine yerleştirin (slaytlar üzerindeki tüm siyah "nokta" işaretleri, bir taşıyıcıya yerleştirildiklerinde aynı yöne bakmalıdır) (Şekil 1B) ve ardından slayt taşıyıcıyı lizis kabının içine yerleştirin (Şekil 3).
12. Lizis kabının kapağını kapatın ve lizis kabını gece boyunca buzdolabında 4 °C veya 30 dakika oda sıcaklığında (operatörün zaman çizelgesine hangisi uygunsa) saklayın.

4. Elektroforez

1. Sürgü taşıyıcıyı lizis kabından dikkatlice çıkarın. Jelleri rahatsız etmemeye özen gösterin.
2. Sürgü taşıyıcıyı buz gibi ddH₂O önceden yüklenmiş bir yıkama kabına nazikçe yerleştirin ve slaytların tamamen ddH₂O ile kaplandığından emin olarak 30 dakika bekletin.
3. Optimum tampon sıcaklığını korumak için elektroforez tankının altındaki sürgülü çekmecenin içine donmuş bir soğutma paketi yerleştirin.
4. Elektroforez tankına buz gibi soğuk elektroforez çalışma solüsyonunu (Tablo 1) dikkatlice ekleyin ve kayar taşıyıcıyı elektroforez tankına aktarın. Slaytları, hücre içeren jellerle (yani buzlu/etiketleme uçları DEĞİL) şeffaf kısımları katoda (kırmızı elektrot) bakacak şekilde yönlendirin.
5. DNA'nın gevşemesi ve gevşemesi için slaytların elektroforez tankında 20 dakika oturmasına izin verin. Bu adım sırasında güç kaynağını kapalı tutun.
6. Gerekirse, soğutmayı en üst düzeye çıkarmak için yeni bir donmuş soğutma paketi yerleştirin.
7. 20 dakika boyunca 1,19 V/cm'de veya optimize edilmiş herhangi bir koşulda elektroforez gerçekleştirin.
   not: Elektroforez çalışma koşullarının ve tampon hacminin optimizasyonu her laboratuvar için önerilir. Elektroforez sırasında sadece tek bir kayar taşıyıcı kullanmak, slaytların elektroforez tamponunun direnci üzerinde herhangi bir etkisine neden olmaz ve yazarlar, slaytların sayısı değiştiğinde voltaj veya akımda önemli bir etki görmediler.
8. Güç kaynağını kapatın, kayar taşıyıcıyı elektroforez tankından dikkatlice çıkarın ve kağıt mendil üzerinde 30 saniye boyunca boşalmasına izin verin.
9. Sürgü taşıyıcıyı nötralizasyon tamponu içeren kabın içine yerleştirin (Tablo 1). 20 dakika bekletin.
10. Sürgü taşıyıcıyı nötralizasyon kabından çıkarın, buz gibi ddH2O içeren yıkama kabına koyun ve 20 dakika bekletin.
11. Sürgü taşıyıcıyı sudan çıkarın ve kaydırakların bir inkübatörde 37 °C'de 1 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin veya operatörün programına bağlı olarak kurumaya bırakın.
    not: Adım 4.11'de kurutma yoksa, 5.2'den itibaren boyama adımını gerçekleştirin.

5. Propidium iyodür (PI) boyama

1. Slaytları yeniden sulandırmak için slayt taşıyıcıyı buz gibi soğuk ddH₂O içeren bir yıkama kabına aktarın ve 30 dakika bekletin.
2. Slayt taşıyıcıyı 2,5 μg/mL propidyum iyodür çözeltisi içeren bir boyama kabına yerleştirin.
   not: Propidyum iyodür ışığa duyarlıdır, bu nedenle karanlık bir alanda tutun. Aynı zamanda toksiktir.
3. Boyama kabının kapağını kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
4. Sürgü taşıyıcıyı ayrı bir kaba aktarın ve buz gibi ddH₂O ile 20 dakika yıkayın.
5. Sürgü taşıyıcıyı tabaktan çıkarın ve operatörün programına veya tercihine bağlı olarak 37 °C'lik bir inkübatörde veya oda sıcaklığında karanlıkta tamamen kurutun.
6. Slaytlar tamamen kuruduktan sonra, slayt taşıyıcısından çıkarın ve görüntü analizi için hazır olana kadar karanlıkta bir slayt kutusunda saklayın.
   not: Slaytlar süresiz olarak okunabilir durumda kalır ve gerekirse yeniden boyanabilir.

6. Kuyruklu yıldız puanlaması ve veri analizi

NOT: "Kuyruklu yıldız" terimi, tahlil yapıldıktan sonra mikroskop altında bakıldığında hasarlı hücrelerin görüntülerinden türetilmiştir (Şekil 4). Elektroforez koşulları altında, hasar görmemiş hücrelerdeki DNA büyük ölçüde göç etmez, ancak kuyruklu yıldız "kafası" olarak adlandırılan bir kürede kalır. Bununla birlikte, iplik kopmalarının varlığı, hücrenin DNA'sının kafadan dışarı çıkmasına ve bir "kuyruk" oluşturmasına izin verir, böylece bir kuyruklu yıldız gibi bir görünüme yol açar (Şekil 4). Kuyrukta ne kadar çok DNA varsa, o kadar fazla hasar vardır.

1. PI (kırmızı) filtre (λ = 536/617 nm) ve kuyruklu yıldız tahlili puanlama yazılımı ile floresan mikroskobunu açın.
2. Jele bir Pasteur pipeti kullanarak bir damla su ekleyin ve bir lamel ile örtün.
3. Slaytları floresan mikroskobuna yerleştirin ve kuyruklu yıldızları "puanlayın".
   not: Puanlama, her bir kuyruklu yıldızda bulunan hasar miktarını belirlemek için kuyruklu yıldızların değerlendirildiği bir araçtır. Genel olarak, bu, kullanıcının seçtiği tercihe göre, ya gözle (kuyruklu yıldızların boyutunu sıfırdan dörde kadar bir ölçekte ölçerek) ya da serbestçe veya ticari olarak temin edilebilen yazılımlar kullanılarak iki yaklaşım kullanılarak elde edilebilir30. Genel olarak, her iki yaklaşım da kuyruklu yıldız kuyruğunun boyutunu değerlendirir, ancak kuyruklu yıldızla ilgili çeşitli uç noktalar belirlenebilir. Yazılımı kullanıyorsanız, kuyruklu yıldız kafasının ortasına tıklayın ve yazılım kuyruklu yıldızı otomatik olarak algılayana kadar bekleyin ve ardından seçilen uç noktayı değerlendirin (Şekil 4).
4. Jel başına 50 kuyruklu yıldız ve örnek başına 100 kuyruklu yıldız puanlayın (yani, her örnek farklı DNA hasar verici tedavilere veya bunların kopyalarına karşılık gelir).
5. Deneyleri tekrarlayın (n = 2) veya deneyleri üçe katlayın (n = 3).
   not: Sadece n = 2 tekrar deneyi yapılırsa, istatistiksel analiz yapılamaz, ancak n = 3 ise, D'agostino normallik testini gerçekleştirin. Çoğu kuyruklu yıldız tahlil verisi bir normallik testini geçmez. Bu durumda, parametrik olmayan bir test kullanın (Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile Kruskal-Wallis testi ve Mann-Whitney testleri anlamlılık p < 0.05 olarak ayarlanmıştır).

reaktif	Stok Çözümü	Çalışma çözümü
Lizis tamponu	ddH2O'da 100 mM Na2EDTA, 2.5 M NaCl ve 10 mM Tris Baz; 10 M NaOH ile pH'ı 10'a ayarlayın	Lizis stok çözeltisinde% 1 Triton X-100
Elektroforez tamponu	ddH2O'da 10 M NaOH ve 200 mM Na2EDTA	300 mM NaOH ve 1 mMNa2EDTA; pH > 13
Nötralizasyon tamponu	ddH2O'da 0.4 M Tris Baz; HCl ile pH'ı 7.5'e ayarlayın
Boyama tamponu	1 mg/mL propidyum iyodür	ddH2O içinde 2.5 μg / mL propidyum iyodür

Tablo 1: Yüksek verimli alkali kuyruklu yıldız testinde (HTP ACA) kullanılan reaktiflerin bileşimi. Lizis, elektroforez, nötralizasyon ve boyama tamponlarının stok ve çalışma konsantrasyonları gösterilmiştir.

Sonuçlar

Şekil 1: Bir kuyruklu yıldız tahlil lamı ve HTP rafının (mikroskop lam taşıyıcısı) temsili görüntüleri. (A) Doğru yönlendirme için, mikroskop lamının önceden kaplanmış yüzü, mikroskop lamının sağ köşesindeki siyah bir nokta ile tanınır. (B) HTP rafının görüntüsü, elektroforez tankı içindeki yönünü sabitlemek için taşıyıcı üzerindeki tırnaklarla kızakların nasıl sıkı bir dikey yönde tutulduğunu gösteri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
22 x 22 mm cam lameller	Fisher Bilimsel, Hampton, NH, Amerika Birleşik Devletleri	631-0124
Floresan mikroskobu donanımlı bir kamera ile	Zeiss, Jena, Almanya
HTP Kuyruklu Yıldız Tahlil sistemi	Satır Bilimsel	COMPAC- 50
İnsan Keratinositi (HaCaT'ler)	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Manassas, VA, Amerika Birleşik Devletleri	Üretilmiyor	Başka bir sitesinden satın alınabilir Şirket ADDEXBIO TEKNOLOJILERI Kedi# T0020001
Hidrojen peroksit (H2O2) Suda% 30	Fisher Bilimsel, Hampton, NH, Amerika Birleşik Devletleri	BP2633-500
Görüntü ve Veri Analizi yazılımı	Algısal Enstrüman, Bury St Edmunds, İngiltere, Birleşik Krallık	125525	Ücretsiz görüntü analizi yazılımı mevcut ör. ImageJ
Düşük erime noktası Agaroz	Canlandırıcı Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	P4864 Serisi
Na2 EDTA (disodyum etilendiamintetraasetik asit)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD	E5134
NaCl (Sodyum klorür)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD	S7653 Serisi
Nanopure Infinity Ultra Saf Su Sistem (Barnstead Nanopure)	Termo Bilimsel, Waltham, MA, ABD	D11901	Ultra saf su (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (sodyum Hidroksit)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	E5134
Normal erime noktası Agaroz	Fisher Bilimsel, Hampton, NH, Amerika Birleşik Devletleri	16520100	Ön kaplama slaytları için
Propidyum İyodür (Suda 1.0 mg / mL)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD	12-541BP486410ML
Tek buzlu cam mikroskobu Slayt	Fisher Bilimsel, Hampton, NH, Amerika Birleşik Devletleri	12-541B
Slayt kutusu	Fisher Bilimsel, Hampton, NH, Amerika Birleşik Devletleri	03-448-2	Hücreleri korumak için ışık geçirmez Oluşum Maceracı Hasar (yaygın görüşe göre) ve floresan solmasını önler boya
Slayt Soğutma plakası	Cleaver Bilimsel, Rugby, İngiltere, Birleşik Krallık	CSL-SOĞUTMA PLAKASI
Tedavi kabı	Cleaver Bilimsel, Rugby, İngiltere, Birleşik Krallık	STAINDISH4X
Tris tabanı	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD	93362
Triton X-100	Fisher Bilimsel, Hampton, NH, Amerika Birleşik Devletleri	BP151-500
Tripsin EDTA (% 0.5)	Canlandırıcı Gibco, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	15400054
Dikey Kızaklı Taşıyıcı	Cleaver Bilimsel, Rugby, İngiltere, Birleşik Krallık	COMPAC-25 (İngilizce