Radyoaktif maddelerin (RAM) kullanımı, her kurumda belirlenmiş bir güvenlik komitesinin önceden onayını gerektirir.
1. Hücrelerde amino asit alımı
- Plaka: 5 x 104 ST2 hücresi, 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunda. %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 0.1 μg/mL streptomisin (Kalem/Strep) içeren α-MEM'deki plaka hücreleri. Adım 1.12'deki normalizasyonlar için koşul başına hücre sayısını ölçmek için fazladan hücre kuyuları oluşturun. Hücreleri, %5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
- Hücreleri birleşene kadar 2-3 gün kültürleyin.
- Deney günü aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.4 ve Krebs Ringers HEPES (KRH) tamponu, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glikoz). 37 °C'ye önceden ısıtın.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL 1x PBS, pH 7.4.
ile iki kez yıkayın
not: Bu protokol aynı zamanda birleşik olmayan hücrelerin hızla bölünmesi için de uygundur. Bu durumda, radyoaktiviteyi mutlak hücre sayısına veya DNA içeriğine normalleştirmek önemlidir. Ek olarak, genel hücre sayısını ve cpm değerlerini artırmak için kültür plakasının veya şişenin boyutunu artırmayı düşünün. Bu, bireysel olarak ampirik olarak belirlemek için önemlidir.
- 1x PBS'yi aspire edin ve hücreleri bir kez 1 mL KRH ile yıkayın.
- 1 mL KRH.
başına 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamin stoğunu seyrelterek 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-Glutamin çalışma ortamı yapın
not: Radyoaktif malzemeleri kullanmadan önce, onay almak için lütfen kendi kurumunuzdaki Radyasyon Güvenliği Ofisi ile iletişime geçin. Radyasyon ile ilgili tüm işlemler pleksiglas kalkanın arkasında yapılmalıdır.
- Hücreleri, 4 μCi / mL L- [3,4-3 H] -Glutamin çalışma ortamı içeren 0.5 mL KRH ile 5 dakika inkübe edin.
- Radyoaktif ortamı toplayın ve sıvı atık kabına dağıtın. Reaksiyonu sonlandırmak için hücreleri buz gibi soğuk KRH ile üç kez kısa bir süre yıkayın. Tüm yıkamaları radyoaktif sıvı atık kabında toplayın ve atın.
- Her oyuğa 1 mL% 1 SDS ekleyin ve hücreleri parçalamak ve homojenize etmek için 10 kat ezin. Hücre lizatlarını 1.5 mL'lik tüplere aktarın. Hücre kültürü plakalarını, serolojik pipetleri ve pipet uçlarını katı radyoaktif atık kabına atın.
- 10 dakika boyunca >10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantları 8 mL sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın. Sintilasyon şişelerini kuvvetlice çalkalayarak karıştırın. Tüpleri ve pipet uçlarını katı radyoaktif atık kabına atın.
- Bir Sintilasyon sayacı kullanarak radyoaktiviteyi dakikadaki sayım (cpm) cinsinden okuyun. Sintilasyon şişelerini sintilasyon şişesi atık kabına atın.
- Parçalanmış, radyoaktif kültürlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için hücreleri kalan radyoaktif olmayan hücre plakalarından tripsnize edin, yeniden süspanse edin ve sayın (bkz. adım 1.1). Bir hemositometre kullanarak, her deneysel koşul için radyoaktif olmayan kuyu başına hücre sayısını sayın. CPM'yi adım 1.11'den radyoaktif olmayan plakalardan tahmini hücre sayısına kadar normalleştirin.
- Deneyin tamamlanmasından sonra, hücre kültürü başlığını, tezgahı ve tüm aletleri bir radyoaktivite dekontaminan sprey ile dekontamine edin. Son olarak, çalışma alanının radyasyon içermediğinden emin olmak için silme testleri yapın.
