$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. C. elegans'ın Senkronize Kültürü
- Tohumlamadan önce, Escherichia coli (E. coli) suşu OP50'yi gece boyunca 37 ° C'de 300 mL Luria-Bertani (LB) suyu sıvı ortamında kültürleyin. Kültürlenmiş OP50'yi -4 °C'de saklayın.
- LB suyunu sıvı ortam yapmak için 10 g tripton, 5 g maya özütü, 10 g NaCl ve 1.5 mL 1 N NaOH kullanın ve deiyonize su ile 1 L'ye ekleyin. Otoklav.
not: OP50 ve C. elegans suşları, Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (Minnesota Üniversitesi, St. Paul, MN, ABD) temin edilebilir.
- Nematod büyüme ortamı (NGM) agar yapmak için 3 g NaCl, 2.5 g pepton, 17 g agar ve 975 mL deiyonize su kullanın. Otoklav. 55 ° C'ye soğutun, daha sonra sırayla 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, EtOH'ye 1 mL 5 mg / mL kolesterol ve 90 mm Petri kaplarına 25 mL 1 M potasyum fosfat pH 6.0 ekleyin.
- 1 M potasyum fosfat pH 6.0 için 108.3 g KH2PO4 ve 46.6 g K2HPO4 kullanın ve 1 L otoklava deiyonize su ekleyin.
- Kültürlenmiş OP50'nin 1-2 mL'sini NGM agar plakalarına yayın. İnce bir OP50 tabakası yapmak için, herhangi bir nematod eklemeden önce plakaları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
not: OP50 aşılanmış NGM agar plakaları oda sıcaklığında 2-3 hafta saklanabilir.
- OP50 ile bir NGM agar plakasına en az 100 solucan ekleyin ve yetişkin aşamasına kadar 20 ° C'de kültürleyin. En az üç plaka gereklidir.
- Yumurtaları uteroda toplamak için, gravid hermafroditleri 15 mL'lik konik bir tüpte her biri 5 mL S tamponu olan üç NGM agar plakasından aktarın ve solucanları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 300 x g'da santrifüjleme kullanarak 15 mL S tamponu ile 3 kez yıkayın.
- S tamponu yapmak için 5.9 g NaCl ve 50 mL 1 M potasyum fosfat pH 6.0 kullanın ve deiyonize su ile 1 L'ye ekleyin. Otoklav.
- Solucanları, aksenizasyon ve toplu yumurta izolasyonu için bir alkali hipoklorit çözeltisi içinde çözün (0.5 mL taze çamaşır suyu veya eşdeğeri:% 5-6 sodyum hipoklorit, 0.1 mL 10 M NaOH, yaklaşık 4.5 mL S tamponu) ve çözeltiyi ters çevirerek karıştırarak oda sıcaklığında 10-15 dakika bekletin.
not: 15 dakika içinde, yetişkin solucanlar çözülmeli ve karkaslarından serbest bırakılmış puslu bir yumurta çözeltisi bırakmalıdır (serbest bırakılan yumurtalar stereoskopik mikroskop kullanılarak doğrulanmalıdır). 0.1 mL 10 N NaOH yerine, 0.2 mL 5 N NaOH de kullanılabilir.
- Hipoklorit işleminden sonra, yumurta peletini 15 mL S tamponu ile 3 kez yıkayın ve 5-6 mL S tamponunda yeniden süspanse edin. Serbest bırakılan yumurtaları, L1 evresi larvalarının yaşa senkronize bir kültürü için E. coli içermeyen S tamponunda 20 ° C'de bir gece inkübasyon sırasında kuluçkadan çıkarın.
- L1 evresi larvaların yaklaşık sayısını belirlemek için, larvaları en az 3 kez süspanse ettikten sonra 10 μL S tamponunda stereoskopik mikroskop kullanarak solucanları sayın ve ortalamayı hesaplayın. Daha sonra, L1 evresi larvalarını OP50 ile beş NGM agar plakasına aktarın (90 mm'lik bir Petri kabı kullanarak plaka başına 1.500-3.000 solucan) ve kendi kendine döllenme başladığında ve birkaç yumurta bırakıldığında (normalde 3 gün sonra) genç yetişkin aşamasına gelene kadar 20 ° C'de kültürleyin.
2. C. elegans'tan Hücresel Fraksiyonun Çıkarılması
- S tamponlu beş NGM agar plakasından genç yetişkin evre (5 günlük hayvanlar) solucanlarını toplayın (Şekil 1A).
- % 30 (a / h) sükroz üzerinde yüzdürme için sakaroz yöntemi 6'yı kullanarak sadece canlı solucanları seçmek için, 3-4 mL S tamponunda süspanse edilmiş solucanları 15 mL'lik konik bir tüpte eşit hacimde buz gibi% 60 (a / h) sükroz ile karıştırın. Tüpü 4 ° C'de 15 saniye boyunca 1.500 x g'da döndürün ve yüzen solucanları bir Pasteur pipeti ile tüpün duvarından uzaklaştırarak yeni bir tüpe çıkarın.
- Solucanları 4 ° C'de 30 saniye boyunca 1.500 x g'da santrifüjleme ile S tamponu ile 3 kez yıkayın. 1.000 μL'lik bir mikropipet ucu kullanarak santrifüjlemeden sonra yıkanmış solucanların ıslak hacmini kontrol edin (Şekil 1B).
- Yıkanmış solucanları, protein çökeltmesi için eşit hacimde buz gibi %10 (a/h) trikloroasetik aside (TCA; nihai konsantrasyon %5) ekleyin (Şekil 1C). TCA yerine perklorik asit (PCA) veya metafosforik asit kullanılabilir.
- Buz üzerinde 1.300 rpm'ye kadar dönüşle bir Teflon homojenizatörde (Potter-Elvehjem doku öğütücü) 40 vuruş havaneli kullanarak solucanları çökeltici ile homojenize edin.
- Homojenatı bir Pasteur pipeti ile taze bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın ve buz üzerinde% 20'lik bir görev döngüsü ile 3 dakika (1 dakikanın 3 katı) boyunca ultrasonik bir homojenizatör kullanarak sonikat yapın.
- Homojenatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleme ile berraklaştırın. Süpernatanları buz üzerinde 20 dakika boyunca 4 M KOH (0.25 hacim ila% 10 TCA) ile nötralize edin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatan (bir test numunesi olarak) aşağıdaki tahlillere kadar -80 °C'de saklanabilir.
3. Kolorimetrik Test Kiti Kullanarak Laktat Testi
- Kolorimetrik bir tahlil kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak test numunelerindeki laktat konsantrasyonunu ölçün. Test numuneleri için çift yönlü incelemeler yapın. 5 veya 10 μL test numunelerini 96 oyuklu bir plakaya ekleyin ve kit ile birlikte verilen Laktat Test Tamponu ile hacmi oyuk başına 50 μL'ye ayarlayın.
- Laktat standart eğrisi için, 100 mM L (+) - Laktat Standardını Laktat Test Tamponu ile 1 mM'ye seyreltin. Kit ile birlikte verilen 1 mM L (+) - Laktat Standardının 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 μL'sini bir dizi kuyucuğa ekleyin.
- 50 μL Reaksiyon Karışımı (46: 2: 2 Laktat Test Tamponu, Laktat Enzim Karışımı ve DMSO'da Laktat Probu içeren, susuz; tüm reaktifler kit ile birlikte verilir) veya Arka Plan Kontrol Karışımı (48: 2 Laktat Test Tamponu ve Laktat Probu içerir) ekleyin ve numuneler ışıktan korunurken oda sıcaklığında 30-60 dakika inkübe edin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun emilimini 570 nm'de ölçün ve Arka Plan Kontrol Karışımının emilimini Reaksiyon Karışımının emiliminden çıkarın.
- Laktat standart eğrisini çizin. Laktat standart eğrisinden test numunelerinin laktat konsantrasyonlarını hesaplayın.
