1. C. elegans'ın Senkronize Kültürü
- Tohumlamadan önce, Escherichia coli (E. coli) suşu OP50'yi gece boyunca 37 ° C'de 300 mL Luria-Bertani (LB) suyu sıvı ortamında kültürleyin. Kültürlenmiş OP50'yi -4 °C'de saklayın.
- LB suyunu sıvı ortam yapmak için 10 g tripton, 5 g maya özütü, 10 g NaCl ve 1.5 mL 1 N NaOH kullanın ve deiyonize su ile 1 L'ye ekleyin. Otoklav.
not: OP50 ve C. elegans suşları, Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (Minnesota Üniversitesi, St. Paul, MN, ABD) temin edilebilir.
- Nematod büyüme ortamı (NGM) agar yapmak için 3 g NaCl, 2.5 g pepton, 17 g agar ve 975 mL deiyonize su kullanın. Otoklav. 55 ° C'ye soğutun, daha sonra sırayla 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, EtOH'ye 1 mL 5 mg / mL kolesterol ve 90 mm Petri kaplarına 25 mL 1 M potasyum fosfat pH 6.0 ekleyin.
- 1 M potasyum fosfat pH 6.0 için 108.3 g KH2PO4 ve 46.6 g K2HPO4 kullanın ve 1 L otoklava deiyonize su ekleyin.
- Kültürlenmiş OP50'nin 1-2 mL'sini NGM agar plakalarına yayın. İnce bir OP50 tabakası yapmak için, herhangi bir nematod eklemeden önce plakaları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
not: OP50 aşılanmış NGM agar plakaları oda sıcaklığında 2-3 hafta saklanabilir.
- OP50 ile bir NGM agar plakasına en az 100 solucan ekleyin ve yetişkin aşamasına kadar 20 ° C'de kültürleyin. En az üç plaka gereklidir.
- Yumurtaları uteroda toplamak için, gravid hermafroditleri 15 mL'lik konik bir tüpte her biri 5 mL S tamponu olan üç NGM agar plakasından aktarın ve solucanları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 300 x g'da santrifüjleme kullanarak 15 mL S tamponu ile 3 kez yıkayın.
- S tamponu yapmak için 5.9 g NaCl ve 50 mL 1 M potasyum fosfat pH 6.0 kullanın ve deiyonize su ile 1 L'ye ekleyin. Otoklav.
- Solucanları, aksenizasyon ve toplu yumurta izolasyonu için bir alkali hipoklorit çözeltisi içinde çözün (0.5 mL taze çamaşır suyu veya eşdeğeri:% 5-6 sodyum hipoklorit, 0.1 mL 10 M NaOH, yaklaşık 4.5 mL S tamponu) ve çözeltiyi ters çevirerek karıştırarak oda sıcaklığında 10-15 dakika bekletin.
not: 15 dakika içinde, yetişkin solucanlar çözülmeli ve karkaslarından serbest bırakılmış puslu bir yumurta çözeltisi bırakmalıdır (serbest bırakılan yumurtalar stereoskopik mikroskop kullanılarak doğrulanmalıdır). 0.1 mL 10 N NaOH yerine, 0.2 mL 5 N NaOH de kullanılabilir.
- Hipoklorit işleminden sonra, yumurta peletini 15 mL S tamponu ile 3 kez yıkayın ve 5-6 mL S tamponunda yeniden süspanse edin. Serbest bırakılan yumurtaları, L1 evresi larvalarının yaşa senkronize bir kültürü için E. coli içermeyen S tamponunda 20 ° C'de bir gece inkübasyon sırasında kuluçkadan çıkarın.
- L1 evresi larvaların yaklaşık sayısını belirlemek için, larvaları en az 3 kez süspanse ettikten sonra 10 μL S tamponunda stereoskopik mikroskop kullanarak solucanları sayın ve ortalamayı hesaplayın. Daha sonra, L1 evresi larvalarını OP50 ile beş NGM agar plakasına aktarın (90 mm'lik bir Petri kabı kullanarak plaka başına 1.500-3.000 solucan) ve kendi kendine döllenme başladığında ve birkaç yumurta bırakıldığında (normalde 3 gün sonra) genç yetişkin aşamasına gelene kadar 20 ° C'de kültürleyin.
2. C. elegans'tan Hücresel Fraksiyonun Çıkarılması
- S tamponlu beş NGM agar plakasından genç yetişkin evre (5 günlük hayvanlar) solucanlarını toplayın (Şekil 1A).
- % 30 (a / h) sükroz üzerinde yüzdürme için sakaroz yöntemi 6'yı kullanarak sadece canlı solucanları seçmek için, 3-4 mL S tamponunda süspanse edilmiş solucanları 15 mL'lik konik bir tüpte eşit hacimde buz gibi% 60 (a / h) sükroz ile karıştırın. Tüpü 4 ° C'de 15 saniye boyunca 1.500 x g'da döndürün ve yüzen solucanları bir Pasteur pipeti ile tüpün duvarından uzaklaştırarak yeni bir tüpe çıkarın.
- Solucanları 4 ° C'de 30 saniye boyunca 1.500 x g'da santrifüjleme ile S tamponu ile 3 kez yıkayın. 1.000 μL'lik bir mikropipet ucu kullanarak santrifüjlemeden sonra yıkanmış solucanların ıslak hacmini kontrol edin (Şekil 1B).
- Yıkanmış solucanları, protein çökeltmesi için eşit hacimde buz gibi %10 (a/h) trikloroasetik aside (TCA; nihai konsantrasyon %5) ekleyin (Şekil 1C). TCA yerine perklorik asit (PCA) veya metafosforik asit kullanılabilir.
- Buz üzerinde 1.300 rpm'ye kadar dönüşle bir Teflon homojenizatörde (Potter-Elvehjem doku öğütücü) 40 vuruş havaneli kullanarak solucanları çökeltici ile homojenize edin.
- Homojenatı bir Pasteur pipeti ile taze bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın ve buz üzerinde% 20'lik bir görev döngüsü ile 3 dakika (1 dakikanın 3 katı) boyunca ultrasonik bir homojenizatör kullanarak sonikat yapın.
- Homojenatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleme ile berraklaştırın. Süpernatanları buz üzerinde 20 dakika boyunca 4 M KOH (0.25 hacim ila% 10 TCA) ile nötralize edin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatan (bir test numunesi olarak) aşağıdaki tahlillere kadar -80 °C'de saklanabilir.
3. Kolorimetrik Test Kiti Kullanılarak Piruvat Testi
- Kolorimetrik bir tahlil kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak süpernatantlardaki (test numuneleri) piruvat konsantrasyonunu ölçün. Test numuneleri için çift yönlü incelemeler yapın. 10 μL test numuneleri ve 90 μL Çalışma Reaktifi (kit ile birlikte verilen 94:1 Enzim Karışımı ve Boya Reaktifi içeren) 96 oyuklu bir plakaya ekleyin ve numuneler ışıktan korunurken oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun emilimini 570 nm'de ölçün.
- Piruvat standart eğrisini çizin. Piruvat standart eğrisinden test numunelerinin piruvat konsantrasyonlarını hesaplayın.
