Glikojen sentaz aktivitesini belirlemek için spektrofotometrik test

Özet

Kaynak: Wilson W.A., Ökaryotik Glikojen Metabolizması Çalışması için Spektrofotometrik Yöntemler. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, glikojen sentaz aktivitesinin tahmini için bir spektrofotometrik test açıklanmaktadır. Yöntem, zamanla NADH absorbansındaki azalmaya dayanır ve glikojen sentaz aktivitesini gösterir.

Protokol

1. Glikojen sentaz aktivitesinin belirlenmesi

1. Tablo 1'de belirtildiği gibi (deney gününden önce) gerekli reaktiflerin stok çözeltilerini hazırlayın.
2. Tahlil gününde, 4.5 mg NADH'yi 1.5 mL 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 içinde çözerek 4 mM NADH'lik taze bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Işıktan koruyarak buz üzerinde saklayın.
3. UDP-glikoz, ATP, fosfoenolpiruvat ve NDP kinaz stok çözeltilerini buz üzerinde çözdürün.
4. Bir su banyosunu önceden 30 °C'ye ısıtın.
5. Tablo 2.
   'de listelenen reaksiyon karışımı reaktiflerini ekleyerek her bir glikojen sentaz testini 1.5 mL'lik bir tüpte ayarlayın not: Kurulumu kolaylaştırmak için, planlanan tahlil sayısını tamamlamak için yukarıda listelenen reaktiflerin her birinden yeterli miktarda içeren bir ana karışım yapılabilir.
6. Yukarıdaki karışımdaki NADH'nin su ile değiştirildiği boş bir reaksiyon hazırlayın. Tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın ve bunu spektrofotometredeki sıfırı 340 nm'ye ayarlamak için kullanın.
7. 1.5 mL'lik bir tüpte 770 μL'lik bir reaksiyon karışımı alikotu alın. 2 μL NDP kinaz ve 2 μL piruvat kinaz/laktat dehidrojenaz karışımı ekleyin, hafifçe karıştırın ve reaksiyon karışımını önceden ısıtmak için 30 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
8. 20 mM Tris tamponunda, pH 7.8'de glikojen sentaz içeren numunenin 30 μL'sini ekleyin; karıştırın ve reaksiyon karışımını tek kullanımlık bir metakrilat küvetine aktarın.
9. Küveti spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı 10 ila 20 dakika boyunca zamanlanmış aralıklarla 340 nm'de kaydedin. Zamana karşı elde edilen absorbansları çizin.
   not: NADH'nin enzimatik olmayan oksidasyonunu kontrol etmek için glikojen sentaz örneğinin 20 mM Tris tamponu ile değiştirildiği bir reaksiyon gerçekleştirilmelidir. Numunenin saflığına bağlı olarak, başka kontrol reaksiyonları gerekebilir.
10. Reaksiyon hızını belirleyin.

Tablo 1: Glikojen sentaz aktivitesinin tahlili için gerekli stok çözeltileri.

parça	Talimatlar
50 mM Tris pH 8.0	0.61 g Tris bazını ~ 80 mL suda çözün. 4 °C'ye soğutun. HCl ile pH'ı 8.0'a ayarlayın ve su ile hacmi 100 mL'ye kadar çıkarın.
20 mM HEPES tamponu	0.477 g HEPE'yi ~ 80 mL suda çözün. NaOH ile pH'ı 7.0'a ayarlayın ve su ile hacmi 100 mL'ye yükseltin.
132 mM Tris/32 mM KCl tampon pH 7.8	1.94 g Tris bazını ve 0.239 g KCl'yi ~90 mL suda çözün. HCl ile pH'ı 7.8'e ayarlayın ve su ile hacmi 100 mL'ye yükseltin.
% 0.8 w / v İstiridye glikojeni	80 mg istiridye glikojenini tartın ve suya ekleyin. Son hacmi suyla 10 mL'ye kadar yapın ve glikojeni tamamen çözmek için hafifçe ısıtın / karıştırın.
100 mM UDP-glikoz	0.31 g UDP-glikozu suda çözün ve son hacmi 1 mL'ye kadar çıkarın. -20 °C'de donmuş alikotlarda saklayın. Birkaç ay stabildir.
50 mM ATP	0.414 g ATP'yi ~ 13 mL suda çözün. NaOH ile pH'ı 7.5'e ayarlayın ve hacmi su ile 15 mL'ye yükseltin. -20 ° C'de donmuş alikotlarda saklayın. Birkaç ay boyunca stabildir.
100 mM Glikoz-6-fosfat pH 7.8	0.282 g glikoz-6-fosfatı ~ 7 ila 8 mL suda çözün. NaOH ile pH'ı 7.8'e ayarlayın. Su ile hacmi 10 mL'ye kadar çıkarın. Dondurulmuş olarak -20 ° C'de alikotlar halinde saklayın. En az altı ay stabildir.
40 mM Fosfoenolpiruvat	4 mg fosfoenolpiruvatı 0.5 mL 20 mM HEPES tampon pH 7.0'da çözün. -20 °C'de saklayın. En az 1 hafta stabildir.
0,5 milyon MnCl2	90 g MnCl2'yi 100 mL suyun son hacminde çözün.
NDP kinaz	Liyofilize tozu 1 U/μl çözelti verecek şekilde yeterli su ile sulandırın. Alikotları hazırlayın, sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın. En az 1 yıl stabildir.

Tablo 2: Glikojen sentaz aktivitesinin tahlili için bileşim reaksiyon karışımı.

adet

parça	Hacim (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl tampon pH 7.8	250
Su	179
100 mM glikoz-6-fosfat, pH 7.8	58
% 0,8 w/v istiridye glikojeni	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-glikoz	28
40 mM fosfoenolpiruvat	20
0,5 milyon MnCl2	8
Son cilt	770

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mumlu mısırdan amilopektin (amiloz içermez)	Balıkçı Bilimsel	A0456
Amiloz	Biyosentetik Karbosentez	YA10257
ATP, disodyum tuzu	MilliporeSigma	A3377
D-Glikoz-1,6-bifosfat, potasyum tuzu	MilliporeSigma	G6893 Serisi
D-glikoz-6-fosfat, sodyum tuzu	MilliporeSigma	G7879
Glikoz-6-fosfat dehidrojenaz, Derece I, mayadan	MilliporeSigma	10127655001
Glikojen, istiridyeden Tip II	MilliporeSigma	G8751
Hekzokinaz	MilliporeSigma	11426362001
Metakrilat küvetler, 1,5 mL	Balıkçı Bilimsel	14-955-128	Bazı prosedürler 340 nm veya altında yapıldığından metakrilat gereklidir
β-Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat sodyum tuzu	MilliporeSigma	N0505
β-Nikotinamid adenin dinükleotid, indirgenmiş disodyum tuzu	MilliporeSigma	43420
Nükleosit 5'-difosfat kinaz	MilliporeSigma	N0379
Fosfoenolpiruvat, monopotasyum tuzu	MilliporeSigma	P7127
Tavşan kasından fosfoglukomutaz	MilliporeSigma	P3397 Serisi
Tavşan kasından elde edilen fosforilaz A	MilliporeSigma	P1261 Serisi
Tavşan kasından piruvat Kinaz / Laktik Dehidrojenaz enzimleri	MilliporeSigma	P0294 Serisi
UDP-glikoz, disodyum tuzu	MilliporeSigma	U4625

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi