Hücresel süreçlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesi için hücresel empedans tabanlı analiz

Özet

Kaynak: Labadie, T., et al., Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında İnfluenza Virüsü Sağkalımını İzleme. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, bir hücresel empedans testi aracılığıyla yapışık hücrelerin çoğalması da dahil olmak üzere hücresel olayların gerçek zamanlı izleme sürecini gösteriyoruz. Burada, yapışık hücreler, elektrotlar arasındaki akım akışını kısıtlayan ve empedansı artıran yalıtkan görevi görür.

Protokol

>NOT: Tüm deneyler sırasında, plakaları her zaman ambalajın üzerindeki kağıt sargıları gibi elektrostatik olmayan yüzeylerde tutun. Elektronik mikrotitre plakasına (E-Plaka olarak tasarlanmıştır) ekilecek en uygun hücre konsantrasyonunu belirlemek için aşağıdaki bölüm 1'i izleyin.

1. Hücreleri enfekte etmek için uygun hücre miktarının belirlenmesi

1. Deneyden 24 saat önce taze bölünmüş hücreler (yaklaşık% 80 birleşme) elde etmek için MDCK (Madin-Darby Köpek Böbreği) hücrelerini 75 cm'lik² şişelerde hazırlayın.
2. Hücreleri 5 mL 1x PBS ile yıkayın ve 3 mL% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek ayırın.
3. 7 mL taze hücre kültürü ortamı ekleyin ve tripan mavisi boyamalı otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
4. Hücre kültürü ortamı ile hücre konsantrasyonunu 400.000 hücre / mL'ye ayarlayın. 200.000 hücre yoğunluğu elde etmek için ek tüplerde iki kat seri seyreltme gerçekleştirin; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; ve 6.250 hücre / mL. Hücrelerin seyreltme aralığını hücre tipine ve büyüme davranışlarına göre ayarlayın.
5. E-plakayı (Malzeme Tablosu) birkaç dakika RT'de bırakın ve çok kanallı bir pipet kullanarak her oyuğa 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. E-Plakanın elektrotlarına dokunmayın.
6. Kızakların kilidini açın ve plakanın ön ucunu empedans ölçüm cihazının (Malzeme Tablosu) beşik cebine yerleştirin. Kuluçka makinesinin kapısını kapatın.
7. Yazılımı açın.
   1. "Varsayılan deneme modeli kurulumu"nda, seçilen beşiği (beşikleri) seçin ve üst sayfayı çift tıklayın, ardından deneyin adını girin. "Düzen" e tıklayın ve plakanın seçilen her bir kuyucuğu için gerekli numune bilgilerini girin; Ardından, işiniz bittiğinde "Uygula" yı tıklayın. "Planla" | "Adımlar" | "Adım ekle"ye tıklayın. Yazılım, arka plan empedansını (CI) ölçmek için otomatik olarak 1 sn'lik bir adım ekler.
   2. "Yürüt" sekmesinde "Başlat/Devam Et"e tıklayın. "Çizim"e tıklayın, uygun kuyucukları seçerek tüm örnekleri ekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce CI'nin -0.1 ile 0.1 arasında olduğundan emin olun.
8. Plakayı kızaktan çıkarın.
9. Adım 1.4'ten itibaren her bir hücre süspansiyonundan 100 μL'yi uygun kuyucuklara çift olarak ve kontrol olarak kullanılan kuyucuklara 100 μL hücre ortamı ekleyin. Kuyucukların dibindeki hücrelerin eşit dağılımına izin vermek için E-plakasını RT'de 30 dakika boyunca laminer akış başlığında bırakın.
10. E-plakayı beşik cebine yerleştirin. Yazılımda "Planla" | "Adım ekle"ye tıklayın ve 200 tekrar için her 30 dakikada bir hücreleri izlemek için değerleri girin. Ardından, "Başlat/Devam Et" seçeneğini seçin.
11. Yazılımdaki "Çizim" düğmesine tıklayarak CI verilerini kontrol edin ve çizin. Viral enfeksiyon sırasında hala büyüme aşamasında olan hücreleri elde etmek için, plaka üzerine tohumlamadan 24 saat sonra durağan fazdan hemen önce olan hücrelerin konsantrasyonunu seçin. CI maksimumda olduğunda durağan faza ulaşılır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
E-Plaka 16 (6 plaka)	ACEA Biyolojik Bilimler A.Ş	5469830001	E-plakalar farklı ambalajlarda mevcuttur
PBS 1X	Yaşam teknolojileri (gibco)	14040091
TPCK-Tripsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Gerçek Zamanlı Hücre Analiz Cihazı S16	ACEA Biyolojik Bilimler A.Ş	380601310	xCELLigence RTCA S16 cihazları farklı formatlarda mevcuttur (16 kuyulu, 96 oyuklu, tek veya çok plakalı)
75 cm2 doku kültürü şişesi	doğan	430641U
MEM 1X	Yaşam teknolojileri (gibco)	31095029

. .