İnfluenza Virüsünün Enfeksiyon Çeşitliliğini Ölçmek için Empedans Bazlı Hücresel Test

Özet

Kaynak: Labadie, T., et al., Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında İnfluenza Virüsü Sağkalımını İzleme. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, CIT₅₀ ile viral enfeksiyonların çokluğu arasındaki korelasyonu tartışıyoruz. Virüsle enfekte olmuş hücreler sitopatik etkiler gösterir, bu da ölümlerine ve altın mikroelektrottan ayrılmalarına neden olur ve bu da empedansı azaltır.

Protokol

1. CIT₅₀ değerleri ile enfeksiyon çokluğu arasındaki korelasyon

1. E-plakasının her bir oyuğuna 100 μL steril 1x MEM kültür ortamı ekleyin. E-plakayı 35°C'de cihazın beşik cebine yerleştirin.
2. Arka planı açıklandığı gibi ölçün:
3. Yazılımı açın.
   1. "Varsayılan deneme modeli kurulumu"nda, seçilen beşiği (beşikleri) seçin ve üst sayfayı çift tıklayın, ardından deneyin adını girin. "Düzen" e tıklayın ve plakanın seçilen her bir kuyucuğu için gerekli numune bilgilerini girin; Ardından, işiniz bittiğinde "Uygula" yı tıklayın. "Planla" | "Adımlar" | "Adım ekle"ye tıklayın. Yazılım, arka plan empedansını (CI) ölçmek için otomatik olarak 1 saniyelik bir adım ekler.
   2. "Yürüt" sekmesinde "Başlat/Devam Et"e tıklayın. "Çizim"e tıklayın, uygun kuyucukları seçerek tüm örnekleri ekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce CI'nin -0.1 ile 0.1 arasında olduğundan emin olun.
4. E-plakayı yuvadan çıkarın.
5. Elektronik mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 3 x 10⁴ taze bölünmüş MDCK hücresi tohumlayın ve bunları 35 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile büyütün, böylece IAV enfeksiyonu sırasında replikatif bir fazda olurlar.
6. Aşağıdaki adımları izleyerek tekrarlanabilirlik için ters pipetleme kullanarak, bilinen 6log 10 TCID₅₀/mL H1N1 virüsünün farklı₁₀kat seyreltmeleriyle MDCK hücrelerini enfekte edin:
   1. MDCK hücrelerini 2x 100 μL MEM ile FCS (virüs yayılma ortamı) olmadan durulayın. Aşının daha fazla seyreltilmesini önlemek için ikinci yıkamadan sonra tüm ortamları çıkarmaya dikkat edin.
   2. Tek kanallı bir pipet kullanarak her oyuğa 100 μL viral süspansiyon ekleyin. Kontaminasyonu önlemek için, soldan sağa, ardından plakada yukarıdan aşağıya doğru devam ederek ve kalan kuyucukları kapakla kapatarak devam edin.
   3. Plakayı 35°C'de cihazın beşik cebine yerleştirin. Potansiyel olarak kontaminasyona yol açan ani hareketlerden kaçınmak için nazik olun.
   4. Açıklandığı gibi en az 100 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre empedansını izlemeye başlayın:
      1. E-plakayı beşik cebine yerleştirin. Yazılımda "Planla" | "Adım ekle"ye tıklayın ve 200 tekrar için her 30 dakikada bir hücreleri izlemek için değerleri girin. Ardından, "Başlat/Devam Et" seçeneğini seçin.
   5. İki ölçüm döngüsünden sonra (yani 30 dakika), "Yürüt" sekmesindeki "Duraklat" düğmesine tıklayarak cihazı duraklatın ve E-plakayı kızaktan çıkarın.
   6. Viral hemaglutinini parçalamak için virüs yayılma ortamına 1μg / mL TPCK-tripsin ekleyin.
   7. Her bir oyuğa TPCK-tripsin içeren 100 μL virüs yayılma ortamı ekleyin ve E-plakayı beşik cebine yerleştirin.
   8. "Yürüt" sekmesinde "Başlat/Devam Et "e tıklayın.
      not: Viral süspansiyonu virüs yayılma ortamı ile değiştirerek sahte enfekte hücrelere karşılık gelen negatif bir kontrol oluşturmayı unutmayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
E-Plaka 16 (6 plaka)	ACEA Biyolojik Bilimler A.Ş	5469830001	E-plakalar farklı ambalajlarda mevcuttur
MEM 1X	Yaşam teknolojileri (gibco)	31095029
TPCK-Tripsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Gerçek Zamanlı Hücre Analiz Cihazı S16	ACEA Biyolojik Bilimler A.Ş	380601310	xCELLigence RTCA S16 cihazları farklı formatlarda mevcuttur (16 kuyulu, 96 oyuklu, tek veya çok plakalı)

. .