1. Reaktiflerin ve başlangıç malzemelerinin hazırlanması
- MDCK hücrelerinin ve steril hücre kültürü ortamının hazırlanması
- % 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS) ve antibiyotikler (100 ünite / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin) ile desteklenmiş modifiye Eagle ortamında (MEM) Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) hücrelerini yetiştirin.
- Çözüldükten sonra, tam iyileşmeyi sağlamak için MDCK hücrelerini enfekte etmeden önce en az 2 kez pasaj yapın (ancak hücre fenotiplerinde herhangi bir kaymayı önlemek için 30'dan az pasaj).
- 7.5 x 106 MDCK hücreli 30 mL steril 1x MEM içeren 75cm2 doku kültürü şişe(ler)ini tohumlayın ve nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Empedans izleme ekipmanının hazırlanması
- Cihazı 35 °C'de inkübatöre yerleştirin ve en az 2 saat ısınmasına izin verin.
- İnkübatörün dışına yerleştirilmiş kontrol ünitesine bağlayın.
- Deneyin geri kalanına başlamadan önce üretici tarafından önerilen temizleme prosedürlerine devam edin.
- MDCK hücreleri üzerinde IAV stoklarının üretimi
- H1N1 virüslerini çoğaltmak ve çoğaltmak için, iki adet 75cm2'lik doku kültürü şişesine 7,5 x 106 MDCK hücresi tohumlayın ve %90-100 birleşmeye ulaşmak için 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- Hücre kültürü ortamını hücre tek tabakasından 75cm'lik 2 şişeler halinde boşaltın. Hücreleri 5 mL steril 1x PBS ile yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve hücreleri tekrar yıkamak için 5 mL 1x PBS ekleyin.
- Bir şişeyi kontrol olarak etiketleyin ve tek tabakaya dikkatlice 15 mL virüs yayma ortamı (%0 FCS ile 1x MEM) eklemeden önce PBS'yi çıkarın. Bu şişeyi% 5 CO2 ile 35 ° C'de tutulan bir inkübatörde inkübe edin. 3 günlük yayılmadan sonra karşılaştırma için kullanın.
- Virüsü, virüs çoğaltma ortamı içeren 1.5 mL'lik bir tüpte (% 0 FCS ile 1x MEM) uygun konsantrasyona seyreltin.
- 75cm'lik 2 şişeden 1x PBS'yi çıkarın ve hücre tek tabakasına 1 mL seyreltilmiş virüs ekleyerek hücre başına 1 x 10-3 veya 1 x 10-4 plak oluşturan birim (pfu / hücre) çok sayıda enfeksiyon (MOI) ile MDCK hücrelerini enfekte edin.
- Şişeyi her 15 dakikada bir düzenli olarak karıştırarak RT'de 45 dakika boyunca virüsü MDCK hücrelerine adsorbe edin.
- Viral hemaglutinin HA0'ı HA1 ve HA2 alt birimlerine ayırmak için inokulumu nazikçe çıkarın ve 1 μg/mL TPCK-tripsin (tripsin/L-1-tosilamid-2-feniletil klorometil keton) içeren şişe başına 15 mL virüs yayılma ortamı ekleyin (endozomal membran ile HA füzyonu ve viral genomun salınması için gerekli olan bir olay).
- Virüsü çoğaltmak için şişeleri 35 °C ve% 5 CO2'de en az 3 gün inkübe edin.
- MDCK hücrelerini mikroskop altında 40x büyütmede gözlemleyin ve hücreler üzerindeki sitopatik etkileri (CPE) arayın (bunları hücre kontrol şişesiyle karşılaştırarak). CPE tam değilse (yani, hücrelerin yaklaşık% 80'i substrattan ayrılırsa), şişeleri 24 saat daha inkübatöre geri koyun.
- CPE tamamlandığında, hücre kültürü süpernatanını boşaltın ve hücresel kalıntıları peletlemek için 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Arıtılmış süpernatanı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve döl virüslerini tek kullanımlık steril kriyojenik şişelere alikot edin. Virüsleri dondurmak ve stoklamak için kriyotüpleri hemen -80 °C'ye yerleştirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek tekrarlanabilirlik için ters pipetleme kullanarak, bilinen 6 log 10 TCID50/mL H1N1 virüsünün farklı10 kat seyreltmeleriyle MDCK hücrelerini enfekte edin:
- MDCK hücrelerini 2x 100 μL MEM ile FCS (virüs yayılma ortamı) olmadan durulayın. Aşının daha fazla seyreltilmesini önlemek için ikinci yıkamadan sonra tüm ortamları çıkarmaya dikkat edin.
- Tek kanallı bir pipet kullanarak her oyuğa 100 μL viral süspansiyon ekleyin. Kontaminasyonu önlemek için, kalan kuyucukları kapakla kapatırken plakada soldan sağa ve ardından yukarıdan aşağıya doğru başlayarak devam edin.
- Plakayı 35 °C'de cihazın beşik cebine yerleştirin. Potansiyel olarak kontaminasyona yol açan ani hareketlerden kaçınmak için nazik olun.
- Adım 2.10'da açıklandığı gibi en az 100 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre empedansını izlemeye başlayın.
- İki ölçüm döngüsünden sonra (yani 30 dakika), "Yürüt" sekmesindeki "Duraklat" düğmesine tıklayarak cihazı duraklatın ve E-plakayı kızaktan çıkarın.
- Viral hemaglutinini parçalamak için virüs yayılma ortamına 1 μg / mL TPCK-tripsin ekleyin.
- Her bir oyuğa TPCK-tripsin içeren 100 μL virüs yayılma ortamı ekleyin ve E-plakayı beşik cebine yerleştirin. 8. "Yürüt" sekmesinde "Başlat/Devam Et"e tıklayın.
not: Viral süspansiyonu virüs yayılma ortamı ile değiştirerek sahte enfekte hücrelere karşılık gelen negatif bir kontrol oluşturmayı unutmayın.
2. IAV hayatta kalma kinetiği
- IAV'yi 35 ° C'de tuzlu damıtılmış suya maruz bırakın ve hücre empedansı düşüşünü ölçerek zaman içindeki enfektivitelerini test edin.
- Damıtılmış suda 35 g / L'lik bir nihai konsantrasyona NaCl ekleyerek tuzlu damıtılmış su hazırlayın. 2 mL kriyotüplere 900 μL tuzlu su ekleyin.
- Tuzlu suya 100 μL viral stok ekleyin ve kriyotüpleri 1 saat, 24 saat veya 48 saat boyunca bir inkübatöre (35 ° C,% 5 CO2) yerleştirin.
- 16 oyuklu bir mikrotitre plaka üzerinde 100 μL (3 x 104 içeren) taze bölünmüş MDCK hücrelerini tohumlayın ve 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat büyütün.
- Bölüm 1.4'ü tekrarlayarak tekrarlanabilirlik için ters pipetleme yöntemini kullanarak 100 μL maruz kalmış virüsle (daha önce kültür ortamında 10 kat seyreltilmiş) hücreleri enfekte edin.
- Hücre empedansını en az 100 saat boyunca her 15 dakikada bir izleyin.
