İnsan Serumunda Oksidatif Stresi Değerlendirmek için Tiyobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Testi

Özet

Kaynak: Borges, C. R. et al., Tiyobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Testi Kullanılarak Biyolojik Örneklerde Oksidatif Stresin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, biyolojik örneklerdeki oksidatif stresi değerlendirmek için tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) testini göstermektedir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir

1. TBARS testi

>NOT: TBARS testi bir kez başlatıldıktan sonra durmadan bitirilmelidir.

1. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjlenmiş çok sayıda numune ve standart alın. Santrifüjleme işleminden sonra, numuneleri ve standartları içeren cam tüpleri, analiz edilecek numune sayısı için gerektiği kadar RT. cam tüplerde saklayın ve numunelerin isimleri ile etiketleyin. Daha sonra, her bir cam tüpe hazırlanan her numuneden (HepG2 hücre lizatları, düşük yoğunluklu lipoproteinler, insan serumu) 100 μL ekleyin.
2. Her numuneye ve standarda 200 μL %8,1 SDS ekleyin ve numuneyi karıştırmak için cam tüpü dairesel hareketlerle hafifçe döndürün.
3. Her numuneye ve standarda 1,5 mL 3,5 M sodyum asetat tamponu (pH = 4) ekleyin.
4. Her numuneye ve standarda 1,5 mL 3,5 M sodyum asetat tamponu (pH = 4) ekleyin.
5. Her numune için son hacmi 4 mL'ye getirin ve 700 μL DI su ekleyerek standartlaştırın.
6. Her bir cam tüpü sıkıca kapatın ve 1 saat boyunca 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Tüplerin üst kısımlarında yoğuşmayı önlemek için cam tüpleri alüminyum folyo ile örtün.
7. Cam tüpleri ısıtma bloğundan çıkarın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
8. Numuneleri ve standartları 1500 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, numuneleri ve standartları içeren cam tüpleri RT.
   not: Numuneleri buz üzerinde veya 4 °C'de tutmak, tüm numunenin veya standardın çökelmesine neden olur.
9. Santrifüjlemeden hemen sonra, her tüpten 150 μL süpernatan alın ve 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyusuna yerleştirin.
10. Bir pipet ucu kullanarak her kuyucuktaki kabarcıkları çıkarın.
    not: Kabarcıkların varlığı, tutarsız absorbans okumalarına neden olacak ve bu da yüksek tahlil belirsizliğine yol açacaktır.
11. 532 nm'de absorbansları okuyun. Boş numunelerin ortalama absorbans okumasını diğer tüm absorbans okumalarından çıkarın.
12. Her standardın bilinen konsantrasyonuna karşı 532 nm'de boş çıkarılmış absorbans okumalarını çizerek standart bir eğri oluşturun. Doğrusal regresyon kullanarak veri noktalarını sığdırın. Standart eğriden elde edilen doğrusal regresyon çizgisinin denklemini kullanarak bilinmeyen numune konsantrasyonlarını hesaplayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1x Steril PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642--262	Hücre lizis reaktifi
50 mL bağımsız santrifüj tüpü	Corning, NY	CLS430897	Genel malzeme
96 oyuklu plaka, İşlenmemiş, şeffaf, kapaklı, Steril olmayan	Thermo Fisher Bilimsel, MA	280895	Absorbansı ölçmek için
Amicon Ultra-0.5 100 kD santrifüj spin filtre cihazı	Balıkçı Bilimsel, NH	UFC510024	LDL saflaştırma
Cam tüpler için kapaklar	Thermo Fisher Bilimsel, MA	14-930-15D	TBARS testi için
Bakır II Klorür	SIGMA, MO	222011-250G	Oksidasyonu indüklemek için
Kültür tüpleri, Tek Kullanımlık, Vidalı Kapaklı, Borosilikat Cam (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	TBARS testi için
Eagle'ın Minimum Temel Ortamı (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 hücre ortamı
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1,5 mL	eppendorf, NY	22363204	Genel malzeme
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	Genel malzeme
Fetal Sığır Serumu ABD Kaynağı	Omega Bilimsel, CA	FB-11	Hücre kültürü için
Buzul Asetik Asit	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reaktifi
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)	Termo Bilimsel, MA	87786	Hücre lizis reaktifi
HEPES ÜNİVERSİTESİ	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL çözücü
Hidroklorik asit (HCl)	Balıkçı Bilimsel, NH	A144-212	Hücre lizis reaktifi
Legend Micro 17 Santrifüj	Termo Bilimsel, MA	75002431	Genel malzeme
Düşük Yoğunluklu Lipoprotein, İnsan Plazması	Atina Araştırma ve Teknoloji, GA	12-16-120412	Biyolojik matris prototipi
Manyetik Karıştırma Çubukları, Sekizgen 6'lı Ürün Çeşitleri	VWR, PA	58948-025	Genel malzeme
Malondialdehit bis (dimetil asetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standardı
Multiskan Go Mikroplaka Spektrofotometresi	Balıkçı Bilimsel, NH	51119200	Absorbansı ölçmek için
NP-40	EMD Millipore A.Ş., MA	492016-100ML	Hücre lizis reaktifi
Sodyum Klorür	SIGMA, MO	S7653-1KG	Hücre lizis reaktifi
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reaktifi
Sodyum hidroksit	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reaktifi
SpeedVac Yoğunlaştırıcı	Termo Bilimsel, MA	SC250EXP	Hücre lizatlarını konsantre etmek için
Tiyobarbitürik Asit	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reaktifi
TRIS tabanı	Fluka, GA	93362	Hücre lizis reaktifi

Serisi Serisi Serisi Serisi