$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hazırlık
- 5 mL Penisilin / Streptomisin (10000 U / mL) ve 5 mL ve 10 mL ticari olarak temin edilebilen takviyeleri 500 mL serumlu tam klasik ortama ekleyin. Başlangıçta ortamın 50 mL'sini aliquot.
not: Kontaminasyonu önlemek için herhangi bir ortamı stoğa geri koymayın.
- Buzun üzerine tam klasik ortamın bir alikotunu koyun.
- Diseksiyon mikroskobunu, forsepsleri ve makası temizlemek için %70 etanol kullanın.
- Biri diseksiyon mikroskobunda ve diğeri buz üzerinde olmak üzere iki hücre kültürü kabı (10 cm) hazırlayın; her tabağa 10 mL tam klasik ortam koyun.
2. Deneysel adımlar (Şekil 1)
- İntraperitoneal olarak enjekte edilen 75-100 mg / kg ketamin ve 7.5-10 mg / kg ksilazin kullanarak doğum sonrası (P) 20 civarında C57BL / 6J fareleri kurban edin. Diseksiyondan önce gözleri buz üzerinde tam klasik ortamda tutun.
- Gözdeki bağ dokusunu (kas ve yağ dokusu) ve optik siniri çıkarın.
- Kornea limbisinin 0,5 mm arkasını çevresel olarak kesmek için bir mikro makas kullanın. Kornea/iris kompleksini, vitreusu ve lensi çıkarın.
- Optik sinire doğru kesilen kenara dik olarak 1 mm'lik bir kesi yapın ve 1 mm genişliğinde çevresel bir bant kesin. Kompleksin merkezi ve çevresel bölgelerini ayırın. Retinayı RPE / koroid / sklera kompleksinden soymak için forseps kullanın.
- Periferik koroid bandını buz üzerinde tam klasik ortamda tutun; diğer gözü izole edin ve ikinci bir bandı kesmek için işlemi tekrarlayın.
- Dairesel bandı 6 ~eşit kare parçaya (~1 mm x 1 mm) kesin.
not: Asla herhangi bir kenara dokunmayın.
- Bazal membran ekstraktını (BME) üreticinin talimatına göre çözün. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunun ortasına 30 μL/kuyu BME ekleyin. BME damlacığının kenarlara dokunmadan plakanın altında dışbükey bir kubbe oluşturduğundan emin olun.
not: BME'yi gece boyunca buzdolabında çözdürün. BME, çözüldükten sonra herhangi bir zamanda buzun üzerinde olmalıdır.
- Dokuyu BME.
'nin ortasına yerleştirin
not: Koroid eksplantını düzleştirmeyin; genel olarak, dokunun BME içinde genişlemesine izin verin. Dokunun oryantasyonu (skleral taraf yukarı veya aşağı) deneysel sonucu etkilemez.
- Jelenin katılaşması için plakayı 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- 500 μL tam klasik ortam/kuyu ekleyin.
- Klasik ortamı iki günde bir değiştirin (500 μL). Mikroskopla 3 gün sonra koroid filizlenmesi gözlenebilir.
not: Büyüme faktörü tedavisi için dokuyu 4 saat aç bırakın. Bir deneme bileşiğini büyüme faktörü azaltılmış bir ortamda seyreltin (1:50 yerine 1:200 artış).
3. SWIFT-Koroid bilgisayarlı kantifikasyon yöntemi (Şekil 2)
NOT: Büyüyen damarların kapladığı alanı ölçmek için bilgisayarlı bir yöntem kullanıldı. Nicelemeden önce ImageJ yazılımına bir makro eklentisi gereklidir.
- Koroid filizlenme görüntüsünü ImageJ ile açın ve "Görüntü |Türü| 8 bit" gri tonlamalı.
- "Görüntü | Ayarla | Parlaklık/Kontrast (Ctrl/shift/ C)" ve kontrastı optimize edin.
- Filizlerin merkezinde bulunan koroid dokusunun ana hatlarını çizmek ve görüntüden çıkarmak için sihirli değnek işlevini kullanın ("F1" kısayol tuşunu kullanarak) (Şekil 2A, B).
not: Sihirli değneğin tolerans oranını %20-30 olarak ayarlayın.
- Serbest seçim araçlarıyla görüntünün arka planını kaldırın (Şekil 2C). "Görüntü | Ayarla | Eşik (Ctrl/shift/T)". Mikrovasküler filizleri arka plana ve çevreye karşı tanımlamak için eşik fonksiyonunu kullanın (Şekil 2D).
- "F2" ye tıklayın ve bir özet görünecektir. "Kaydet" i tıklayarak seçilen alanın bir görüntüsünü kaydedin. İleride başvurmak üzere orijinal görüntüyle aynı klasöre kaydedin.
- Bir grup numune ölçüldükten sonra, veri analizi için kaydedilen numuneyi kopyalayın.
not: Alanı (μm²) "Analiz | Ölçek çubuklu görüntüleri kullanarak "Ölçeği Ayarla".
